Descripción general
La secuenciación de ARN pequeño se dirige a la clase de moléculas cortas de ARN no codificantes (normalmente de 18 a 35 nucleótidos de longitud) que desempeñan funciones reguladoras críticas en la expresión genética. Estos incluyen microARN (miARN), pequeños ARN de interferencia (siARN) y ARN que interactúan con Piwi (piARN). A pesar de su pequeño tamaño, estas moléculas ejercen un poderoso control sobre la estabilidad del ARNm, la traducción, el estado de la cromatina y el silenciamiento de los transposones. Small RNA-seq requiere una preparación de biblioteca especializada para capturar fragmentos tan cortos y herramientas bioinformáticas distintas para una anotación y cuantificación precisas.
Métodos
La preparación de una biblioteca pequeña de RNA-seq implica la selección del tamaño del ARN (normalmente mediante escisión en gel o purificación basada en perlas), ligadura de adaptadores 3’ y 5’, transcripción inversa y amplificación por PCR. Debido a que los ARN pequeños son más cortos que la longitud leída, se secuencian por completo y las secuencias adaptadoras deben recortarse con precisión durante el preprocesamiento. Las herramientas de alineación dedicadas (como miRDeep2, sRNAbench o ShortStack) asignan lecturas a pequeñas bases de datos de ARN conocidas (miRBase para miRNA, Rfam para otros ncRNA). La cuantificación estima los niveles de expresión de miARN conocidos, mientras que la detección de miARN nuevos se basa en estructuras precursoras en horquilla características. El análisis de expresión diferencial sigue principios similares al de mRNA-seq pero con consideraciones especiales para la normalización porque los ARN pequeños tienen diferentes distribuciones de longitud y sesgos de GC.
Aplicaciones
Los perfiles de ARN pequeños han revelado las funciones reguladoras generalizadas de estas moléculas. Las firmas de miARN distinguen los subtipos de cáncer y predicen la respuesta al tratamiento. Los miARN circulantes en sangre o suero sirven como biomarcadores mínimamente invasivos para enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la neurodegeneración. El análisis se conecta con estudios más amplios de estructura y tipos de ARN y regulación genética y epigenética, ya que muchos ARN pequeños participan en bucles reguladores con factores de transcripción y modificadores epigenéticos. La comprensión de la biogénesis de ARN pequeños también se basa en conceptos de transcripción y procesamiento de ARN, en particular el papel de Drosha y Dicer en la maduración de miARN.
Protocolo práctico
La preparación de una pequeña biblioteca de RNA-seq comienza con la entrada de ARN total (100 a 1000 ng). La selección del tamaño es fundamental: los fragmentos de ARN de 18 a 35 nt se aíslan mediante escisión en gel de un gel de poliacrilamida al 15 % o mediante purificación basada en perlas con perlas AMPure XP en concentraciones específicas de PEG. La ligadura del adaptador utiliza ARN ligasa 2 de T4 truncada para el adaptador 3’ (minimizando la circularización) y ARN ligasa 1 de T4 para el adaptador 5’. Después de la transcripción inversa con SuperScript III, el ADNc se amplifica por PCR (12 a 15 ciclos para evitar una amplificación excesiva) y se selecciona nuevamente el tamaño para eliminar los dímeros adaptadores. Para el preprocesamiento, Cutadapt recorta las secuencias del adaptador con precisión: cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG --discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq. El indicador --discard-untrimmed elimina las lecturas sin un adaptador detectable. Para el descubrimiento y la cuantificación de miARN, “miRDeep2” proporciona un proceso completo: ejecute “mapper.pl” para procesar lecturas, “miRDeep2.pl” para identificar miARN conocidos y novedosos frente a miRBase y “quantifier.pl” para cuantificar la expresión. El proceso califica a los precursores de miARN candidatos mediante la evaluación de la estructura de horquilla característica: una puntuación de miRDeep2 superior a 10 indica predicciones de alta confianza. Las herramientas alternativas incluyen “sRNAbench” para especies con anotaciones de miRBase incompletas y “ShortStack” para el descubrimiento de novo de ARN pequeño sin un genoma de referencia. La normalización de datos de expresión de ARN pequeños requiere atención especial; Las opciones incluyen TPM (transcripciones por millón), lecturas por millón (RPM) o el uso de controles de aumento como el cel-miR-39 sintético. El análisis de expresión diferencial se puede realizar con “DESeq2” en los datos de recuento, pero la estimación del factor de tamaño debe utilizar únicamente recuentos de miARN en lugar de lecturas mapeadas totales para evitar sesgos debidos a abundantes ARN pequeños que no son miARN.
