Antes de que CRISPR/Cas9 se convirtiera en la plataforma dominante de edición genómica, los TALENs y las ZFN eran las herramientas principales para la modificación genómica dirigida. Ambas utilizan un dominio de unión al ADN modular fusionado al dominio endonucleasa de FokI.

Nucleasas de Dedo de Zinc

Una ZFN consta de 3–6 módulos de dedo de zinc, cada uno reconociendo 3–4 pb de ADN. Dos monómeros de ZFN se unen a sitios adyacentes con un espaciador de 5–7 pb entre ellos. FokI debe dimerizarse para cortar el ADN, por lo que solo el complejo ZFN-FokI emparejado crea una rotura de doble cadena.

Los módulos de dedo de zinc no son verdaderamente modulares: la especificidad de cada dedo está influenciada por sus vecinos, lo que dificulta el diseño de ZFN. La mayoría de las ZFN deben seleccionarse de grandes bibliotecas combinatorias o diseñarse utilizando plataformas patentadas (Sangamo Biosciences). Esta complejidad limitó la adopción de ZFN a pesar de su éxito en ensayos terapéuticos tempranos (SB-728-T para VIH, fase 1).

TALENs

Los TALENs utilizan el dominio de unión al ADN de efectores TAL de bacterias Xanthomonas. Cada repetición TAL reconoce un solo nucleótido a través de dos residuos de aminoácidos hipervariables (el diresiduo variable de repetición, RVD). El código es simple y predecible:

• HD → C
• NG → T
• NI → A
• NN → G o A
• NH → G (mayor especificidad)

Una matriz TALEN típica tiene 12–20 repeticiones que se dirigen a una secuencia de 12–20 pb. Al igual que las ZFN, los TALENs se usan como un par que flanquea un espaciador de 12–20 pb, con los dominios FokI dimerizándose a través del espaciador.

El ensamblaje de TALEN es modular, cada repetición es una parte estandarizada, y métodos como la clonación Golden Gate (MoClo, Golden TALEN, FLASH) permiten el ensamblaje de matrices TALEN a partir de módulos de repetición prefabricados.

Comparación con CRISPR/Cas9

Los TALENs ofrecen la tasa más baja de efectos fuera de diana de las tres plataformas porque el sitio diana es más largo y cada repetición TAL se une a un solo nucleótido. Sin embargo, el gran tamaño de cada monómero TALEN (~3 kb) dificulta su entrega en vectores AAV. Las ZFN son lo suficientemente pequeñas para el empaquetamiento en AAV pero son difíciles de diseñar internamente.

Aplicaciones

Las ZFN y los TALENs todavía se utilizan en aplicaciones donde el corte fuera de diana debe minimizarse absolutamente (p. ej., edición terapéutica en células madre) o donde los requisitos de PAM de CRISPR son restrictivos. Los TALENs no tienen requisito de PAM y pueden dirigirse a cualquier secuencia, incluyendo secuencias que carecen de PAM NGG.