El sistema de doble híbrido en levadura detecta interacciones proteína-proteína en células de levadura vivas reconstituyendo un factor de transcripción funcional. Es un método potente y ampliamente utilizado para descubrir y caracterizar interacciones binarias de proteínas.

Principio

El sistema se basa en la naturaleza modular de los factores de transcripción, que tienen dominios separados de unión a ADN y de activación. La proteína de interés, o cebo, se fusiona al dominio de unión a ADN de un factor de transcripción como Gal4. Las posibles proteínas interactuantes, o presas, se fusionan al dominio de activación. La interacción entre el cebo y la presa acerca el dominio de activación al dominio de unión a ADN, reconstituyendo un factor de transcripción funcional que activa la expresión de genes reporteros.

Componentes

El cebo típicamente se clona en un vector que expresa la proteína cebo fusionada al dominio de unión a ADN de Gal4. La presa se expresa a partir de un vector de biblioteca fusionado al dominio de activación de Gal4. Ambos plásmidos se transforman en una cepa de levadura reportera que contiene uno o más genes reporteros bajo el control de secuencias de activación corriente arriba sensibles a Gal4.

Los genes reporteros comúnmente incluyen HIS3, que permite el crecimiento en medio deficiente en histidina, ADE2 para la biosíntesis de adenina, y lacZ o GFP para detección colorimétrica o fluorescente. Múltiples reporteros con diferentes promotores reducen los falsos positivos. Los marcadores contra-seleccionables como URA3 y CYH2 pueden eliminar falsos positivos mediante selección negativa bajo ciertas condiciones.

Cribado de Bibliotecas

Un cribado típico de Y2H comienza con la construcción de una biblioteca de ADNc en el vector de presa. El cebo se transforma en la cepa de levadura reportera, y la biblioteca de presas se introduce mediante transformación a gran escala. Los transformantes se siembran en medio selectivo que requiere interacción para el crecimiento. Las colonias que aparecen después de 3 a 7 días se recogen, y los plásmidos de presa se recuperan y secuencian para identificar la proteína interactuante.

El cribado requiere una optimización cuidadosa. El cebo debe probarse para autoactivación, donde el cebo solo activa la transcripción del reportero. Si ocurre autoactivación, el cebo puede truncarse o pueden usarse vectores alternativos. El nivel de expresión tanto del cebo como de la presa afecta la sensibilidad. Los cribados de alto rendimiento que usan automatización y estrategias de agrupamiento permiten el mapeo de interacciones de proteomas completos.

Ventajas y Limitaciones

Y2H detecta interacciones directas y binarias y puede identificar interacciones débiles o transitorias que podrían pasarse por alto mediante co-inmunoprecipitación y otros métodos bioquímicos de extracción y purificación de proteínas. El sistema es escalable para alto rendimiento, rentable y no requiere anticuerpos específicos de proteína. Las interacciones se detectan en un entorno celular eucariota.

Las limitaciones incluyen falsos positivos de autoactivadores, proteínas pegajosas e interacciones fortuitas. Los falsos negativos ocurren cuando las proteínas no se pliegan correctamente en levadura, requieren modificaciones postraduccionales ausentes en levadura, o son tóxicas cuando se sobreexpresan. Las proteínas de membrana son problemáticas porque la localización nuclear del sistema es incompatible con los entornos de membrana. Variantes como el sistema de ubiquitina dividida abordan algunas de estas limitaciones.

Variantes

Varias variantes de Y2H extienden la técnica básica. El sistema de doble híbrido inverso detecta la interrupción de interacciones mediante el cribado de pérdida de expresión del reportero, útil para identificar mutaciones o fármacos que interrumpen interacciones específicas. El sistema de un solo híbrido detecta interacciones proteína-ADN fusionando el dominio de unión a ADN a un factor de transcripción conocido y cribando para activación. El sistema de triple híbrido detecta interacciones ARN-proteína usando una molécula de ARN híbrido que puentea el cebo y la presa.

El doble híbrido de membrana usa el enfoque de ubiquitina dividida, donde el cebo y la presa se fusionan a mitades de ubiquitina. La interacción reconstituye la ubiquitina completa, que es escindida por proteasas específicas de ubiquitina, liberando un factor de transcripción que activa genes reporteros. Esto permite la detección de interacciones que involucran proteínas de membrana en su entorno nativo.

Aplicaciones

Y2H se ha utilizado para generar mapas de interacción a escala de proteoma para organismos incluyendo levadura, mosca, gusano y humano. Estos mapas revelan módulos funcionales, identifican nuevos componentes de rutas y predicen funciones de proteínas no caracterizadas. Los cribados de Y2H han identificado interacciones relevantes para enfermedades, como interacciones entre proteínas codificadas por genes vinculados a trastornos genéticos. La tecnología también se ha aplicado para mapear interacciones huésped-patógeno, revelando cómo las proteínas virales y bacterianas subvierten la maquinaria celular del huésped.