O espectrofotômetro é o instrumento mais comum em qualquer laboratório. Ele mede quanta luz uma amostra absorve em um determinado comprimento de onda, que é proporcional à concentração da espécie absorvente.
A Lei de Beer–Lambert
A relação fundamental é:
A = ε × b × c
onde A é a absorbância (sem unidades), ε é a absortividade molar (L·mol⁻¹·cm⁻¹), b é o caminho óptico (cm) e c é a concentração (mol/L). A lei vale para soluções diluídas (tipicamente A < 1,5). Em concentrações mais altas, ocorrem desvios devido a interações moleculares e luz parasita instrumental.
Componentes do Instrumento
- Fonte de luz: lâmpada de deutério para UV (190–350 nm), lâmpada de tungstênio-halogênio para visível (350–900 nm). Lâmpadas de xenônio flash são usadas em alguns instrumentos modernos.
- Monocromador: uma grade ou prisma que seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda. A largura de banda afeta a qualidade da medição — largura de banda mais estreita proporciona melhor linearidade.
- Compartimento de amostra: comporta a cubeta. A maioria dos instrumentos aceita cubetas de 1 cm de caminho óptico. Cubetas são de quartzo (para UV) ou vidro/plástico (apenas para visível).
- Detector: um tubo fotomultiplicador ou fotodiodo que converte a luz transmitida em um sinal elétrico.
Etapas de Operação
- Ligue o instrumento e permita que a fonte de luz aqueça (15–30 minutos para lâmpadas de deutério).
- Selecione o comprimento de onda de medição.
- Preencha uma cubeta com a solução branco (o solvente sem analito).
- Coloque o branco no suporte de amostra e ajuste a absorbância para zero (autozero).
- Meça a amostra e registre a absorbância.
- Para múltiplas amostras, reajuste o zero com o branco periodicamente.
Manuseio de Cubetas
Manuseie as cubetas pelas laterais foscas ou estriadas — impressões digitais nas janelas ópticas dispersam a luz e aumentam a absorbância. Enxágue as cubetas com a solução da amostra antes de preencher. Certifique-se de que não há bolhas no caminho da luz.
Aplicações Comuns
- Quantificação de ácidos nucleicos: medição em A₂₆₀ (1 DO₂₆₀ ≈ 50 µg/mL de dsDNA, 40 µg/mL de RNA, 33 µg/mL de ssDNA). Pureza avaliada pela razão A₂₆₀/A₂₈₀ (≈1,8 para DNA puro, ≈2,0 para RNA puro).
- Quantificação de proteínas: os ensaios Bradford, BCA e Lowry usam espectrofotometria visível.
- Cinética enzimática: monitoramento contínuo do consumo de NADH a 340 nm ou formação de produto em um comprimento de onda específico.
- Curvas de crescimento bacteriano: turbidez medida a 600 nm (DO₆₀₀).
- Ensaios colorimétricos químicos: quase qualquer analito pode ser medido se reagir para formar um produto colorido.
