流式细胞术是一种基于激光的技术，当数千个单个细胞以单行流流过光学检测器时，每秒可快速测量它们的物理和化学特性。它能够以单细胞分辨率对细胞群进行多参数分析。

原则

悬浮细胞通过流体动力学聚焦成一条狭窄的流，确保它们单独通过一束或多束激光束与流相交的询问点。当每个细胞通过激光时，如果用荧光团标记，它会散射光并发出荧光。散射和发射的光由探测器收集，转换为电子信号，并数字化以进行分析。

前向和侧向散射

前向散射测量以小角度散射的光，与细胞大小相关。较大的细胞向前散射更多的光。侧向散射测量 90 度散射的光，反映细胞粒度和内部复杂性。具有许多颗粒的中性粒细胞具有高侧向散射，而淋巴细胞具有低侧向散射。 FSC 和 SSC 一起可以在不进行任何染色的情况下区分血液中的主要白细胞群。

荧光检测

当被激光激发的荧光团返回基态时，就会发出荧光。细胞通常用针对特定表面或细胞内标记物的荧光偶联抗体进行染色，类似于 ELISA 中基于抗体的检测。每个荧光团都具有特征激发和发射光谱。流式细胞仪使用二向色镜和带通滤光片将荧光分离到不同的检测器通道中，每个通道测量特定的波长范围。

荧光团

常见的荧光团包括 FITC、PE、APC、PerCP 和 Alexa Fluor 染料。 PE-Cy7 等串联染料结合了两种荧光团，其中从供体到受体的能量转移会产生较大的斯托克斯位移。现代细胞仪可以使用多个激光器和检测器同时测量 12 至 50 个参数。

补偿校正荧光团之间的光谱重叠。当一种荧光团的发射光谱溢出到另一种荧光团的检测器中时，必须以数学方式减去其贡献。使用单染样品的补偿控制对于准确的多色分析至关重要。

细胞分选

荧光激活细胞分选根据细胞的测量特性对细胞进行物理分离。分选器使用振动喷嘴产生含有单细胞的液滴。根据细胞的测量特性，液滴带电，并通过静电板偏转到收集管中。分选纯度通常超过 95%。无菌分选可用于下游培养或功能测定。

应用程序

免疫表型分析使用谱系特异性标记物组来识别和量化免疫细胞子集。 HIV 监测中的 CD4 T 细胞计数是流式细胞术的临床应用。细胞周期分析使用碘化丙啶或 DAPI 染色测量 DNA 含量，识别 G1、S、G2 和 M 期群体。

细胞凋亡检测用膜联蛋白 V 检测磷脂酰丝氨酸暴露，用碘化丙啶或 7-AAD 检测膜通透性，用荧光抑制剂检测 caspase 激活。细胞内细胞因子染色可测量活化 T 细胞中细胞因子的产生。 Phospho-flow 以单细胞分辨率测量信号蛋白的磷酸化，类似于 [Western blot](/guides/western-blot.html) 分析。无需抗体染色即可测量 GFP 等报告基因的荧光蛋白表达。

光谱流式细胞仪

光谱流式细胞术使用衍射光栅或棱镜跨多个检测器捕获每个细胞的完整发射光谱，而不是在离散通道中进行测量。光谱解混合算法对每个荧光团的贡献进行去卷积。这种方法可容纳更多具有相似光谱的荧光团，并通过减少补偿要求来简化面板设计。

质谱流式细胞术

质谱流式细胞术使用与稳定重金属同位素而不是荧光团缀合的抗体。将细胞引入电感耦合等离子体质谱仪，使金属原子化和电离。每种同位素质量均通过飞行时间质谱法测量。质谱流式分析仪可以测量 40 个或更多参数，而不会出现光谱重叠或自发荧光。然而，细胞在分析过程中被破坏且无法恢复。该技术的通量低于传统流式细胞术。