Die Aminosäuresynthese umfasst die Stoffwechselwege, über die Zellen Aminosäuren produzieren. Der Mensch kann elf der zwanzig Standardaminosäuren synthetisieren, während die restlichen neun – sogenannte essentielle Aminosäuren – über die Nahrung aufgenommen werden müssen.
Essentielle vs. nicht-essentielle Aminosäuren
Essentielle Aminosäuren
Der Mensch kann Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin nicht synthetisieren. Diese müssen über die Nahrung zugeführt werden. Der Mangel an essentiellen Aminosäuren führt zu einem Proteinmangel, da für die Proteinsynthese alle zwanzig Aminosäuren gleichzeitig benötigt werden.
Nicht-essentielle Aminosäuren
Die restlichen elf Aminosäuren können vom menschlichen Körper selbst synthetisiert werden. Sie werden aus gängigen Stoffwechselzwischenprodukten wie Alpha-Ketosäuren hergestellt, die aus der Glykolyse und dem Zitronensäurezyklus stammen.
Biosynthesewege
Transaminierung
Der erste Schritt bei der Synthese vieler Aminosäuren ist die Transaminierung. Eine Alpha-Ketosäure übernimmt eine Aminogruppe von einer anderen Aminosäure (normalerweise Glutamat), katalysiert durch Aminotransferasen. Diese Reaktion wandelt die Ketosäure in eine Aminosäure um.
Familien von Aminosäuren
Aminosäuren werden auf der Grundlage ihrer biosynthetischen Vorläufer in Familien eingeteilt: Aus Alpha-Ketoglutarat entstehen Glutamat, Glutamin, Prolin und Arginin; aus Oxalacetat entstehen Aspartat, Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin; aus Pyruvat entstehen Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; aus 3-Phosphoglycerat entstehen Serin, Glycin und Cystein; aus Shikimat entstehen Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; und aus Ribose-5-phosphat entsteht Histidin.
Verordnung
Die Aminosäuresynthese wird durch Feedback-Hemmung streng reguliert. Das Endprodukt eines Stoffwechselwegs hemmt das erste aktivierte Enzym und verhindert so eine Überproduktion. Dadurch können Zellen die Aminosäureproduktion an ihren Bedarf anpassen.
Praktische Aminosäureanalyse mittels HPLC
Bereiten Sie Proben (z. B. Plasma, Zelllysat oder Kulturmedien) durch Deproteinisierung mit einem gleichen Volumen 10 % Trichloressigsäure oder Sulfosalicylsäure vor. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 10.000 × g und sammeln Sie den Überstand. Aminosäuren für den Nachweis derivatisieren: Zur Vorsäulenderivatisierung 10 µL Probe mit 70 µL Boratpuffer (pH 8,8) und 20 µL o-Phthaldialdehyd (OPA)-Reagenz mit 3-Mercaptopropionsäure mischen. Genau 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann 10 µL auf eine Umkehrphasen-C18-Säule (4,6 × 150 mm, 5 µm) injizieren, die mit 40 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) äquilibriert ist. Eluieren Sie mit einem Acetonitril-Gradienten (0–60 % über 30 Minuten) bei 1 ml/min. Erkennen Sie OPA-derivatisierte Aminosäuren durch Fluoreszenz (Anregung 340 nm, Emission 450 nm). Alternativ können nichtderivatisierte Aminosäuren durch Kationenaustauschchromatographie mit Nachsäulen-Ninhydrin-Detektion getrennt werden. Kapillarzonenelektrophorese (CZE) bietet einen alternativen Ansatz für die Aminosäureanalyse und ermöglicht die Trennung von derivatisierten und nicht derivatisierten Aminosäuren mit hoher Effizienz und kurzen Analysezeiten – Aminosäuren reagieren mit Ninhydrin bei 130 °C und bilden ein violettes Produkt (Ruhemanns Purpur), das bei 570 nm nachgewiesen wird, während Prolin und Hydroxyprolin bei 440 nm ein gelbes Produkt ergeben. Quantifizieren Sie jede Aminosäure, indem Sie die Peakflächen mit einer Standardmischung aus 20 Aminosäuren bei bekannten Konzentrationen vergleichen. Stellen Sie bei der Formulierung von Zellkulturmedien sicher, dass alle essentiellen Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Valin) je nach Zelltyp in einer Menge von 0,5–12 mM vorhanden sind. Glutamin wird aufgrund seiner Instabilität in Lösung typischerweise in einer Menge von 2–4 mM zugesetzt – es zerfällt bei 37 °C zu Glutamat und Ammoniak mit einer Halbwertszeit von ca. 5 Tagen.
Reale Anwendung
In Fed-Batch-CHO-Zellkulturen für die Produktion monoklonaler Antikörper zeigt die tägliche HPLC-Analyse des verbrauchten Mediums, dass Glutamin, Asparagin und Serin nach Tag 5 erschöpft sind. Am Tag 6 wird ein gezieltes Futter mit diesen drei Aminosäuren hinzugefügt, wodurch die Lebensfähigkeit der Kultur von Tag 10 auf Tag 14 verlängert und der Antikörpertiter um 40 % erhöht wird.
