Die analytische Ultrazentrifugation (AUC) ist eine biophysikalische Technik, die Makromoleküle in Lösung durch ihr Sedimentationsverhalten unter hohen Zentrifugalkräften charakterisiert. Sie bestimmt Molekulargewicht, hydrodynamische Form, Bindungsstöchiometrie und Gleichgewichtskonstanten ohne Standards oder Säulenkalibrierung.
Zwei komplementäre Experimente werden durchgeführt. Die Sedimentationsgeschwindigkeit zentrifugiert Proben bei hoher Geschwindigkeit und überwacht die radiale Bewegung der Grenzfläche, während Moleküle sedimentieren. Das Sedimentationsgleichgewicht verwendet niedrigere Geschwindigkeiten, bei denen Sedimentation durch Diffusion ausgeglichen wird, wodurch ein exponentieller Konzentrationsgradient im Gleichgewicht entsteht.
Die Sedimentationsgeschwindigkeits-AUC liefert die Sedimentationskoeffizientenverteilung. Der Sedimentationskoeffizient hängt von der Molekülmasse und dem Reibungskoeffizienten ab. Der Reibungskoeffizient gibt Aufschluss über die Molekülform. Der Diffusionskoeffizient wird aus der Grenzflächenverbreiterung gewonnen. Die Svedberg-Gleichung setzt diese Parameter in Beziehung. Die Analyse mit kontinuierlichen c(s)-Verteilungsmodellen in Programmen wie SEDFIT berücksichtigt diffusionsentfaltete Sedimentationskoeffizienten.
Das Sedimentationsgleichgewichts-AUC liefert das Molekulargewicht unabhängig von der Form. Der Gleichgewichtskonzentrationsgradient folgt einer Exponentialfunktion der radialen Position. Für eine einzelne ideale Spezies wird das Molekulargewicht aus der Steigung des ln c gegenüber r-Diagramms bestimmt. Mehrkomponentenanalyse löst Gemische auf und bestimmt Assoziationskonstanten für wechselwirkende Systeme.
Detektionssysteme umfassen Absorptionsoptik, Rayleigh-Interferenzoptik und Fluoreszenzdetektion. Die Absorptionsdetektion ist wellenlängenspezifisch und für chromophore Proben geeignet. Die Interferenzdetektion misst Konzentrationsänderungen für alle gelösten Stoffe und ist empfindlicher. Die Fluoreszenzdetektion erreicht Einzelmolekülempfindlichkeit für markierte Proben.
AUC-Anwendungen umfassen die Charakterisierung von Protein-Oligomerisierung, Antikörperaggregation, Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, Lipoprotein-Heterogenität und Nanopartikel-Größenverteilung und ergänzt Methoden wie die dynamische Lichtstreuung. Die Technik ist markierungsfrei und arbeitet unter nativen Lösungsbedingungen. Sie gilt als Goldstandard für die Bestimmung der hydrodynamischen Eigenschaften von Makromolekülen.
Zu den Probenanforderungen gehören optische Transparenz, geeignete Pufferdichte und -viskosität sowie ausreichende Konzentration für die Detektion. Typische Konzentrationen reichen von 0,1 bis 10 mg/mL für die Absorptionsdetektion.
