Apoptose ist ein regulierter, energieabhängiger Prozess des Zelltods, der durch charakteristische biochemische und morphologische Veränderungen gekennzeichnet ist. Kein einzelner Assay erfasst alle Aspekte, die meisten Experimente verwenden eine Kombination von Methoden, die auf verschiedene Merkmale abzielen.
Caspase-Aktivitätsassays
Caspasen sind Cystein-Asparaginsäure-Proteasen, die das apoptotische Programm ausführen. Caspase-3 und -7 sind die primären Exekutionscaspasen.
Fluorogene Substrate: Eine Peptid-Erkennungssequenz (DEVD für Caspase-3/7), verbunden mit einem Fluorophor (AMC, AFC). Aktive Caspase spaltet das Peptid und setzt das Fluorophor frei. Die Fluoreszenz (ex/em 355/460 nm für AMC) wird in einem Plattenleser gemessen. Der Assay ist einfach, quantitativ und für das Hochdurchsatz-Screening geeignet.
FRET-basierte Reporter: Zellen, die ein DEVD-Peptid exprimieren, das von einem Fluoreszenzprotein-Paar flankiert wird (z. B. CFP–DEVD–YFP), wechseln nach Caspase-Spaltung von FRET zu Donor-Emission. Diese Reporter ermöglichen die Echtzeit-Überwachung der Apoptose in lebenden Zellen mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie.
Annexin V / Propidiumiodid
In der frühen Apoptose wird Phosphatidylserin (PS) von der inneren auf die äußere Seite der Plasmamembran transloziert. Annexin V bindet PS mit hoher Affinität in Ca²⁺-abhängiger Weise. Konjugiert mit FITC, PE oder APC markiert es frühe apoptotische Zellen.
Propidiumiodid (PI) ist ein membranundurchlässiger DNA-Farbstoff, der nur eindringt, wenn die Zellmembran beeinträchtigt ist (späte Apoptose oder Nekrose). Die Doppelfärbung unterscheidet:
- Vital: Annexin V⁻/PI⁻
- Frühapoptotisch: Annexin V⁺/PI⁻
- Spätapoptotisch: Annexin V⁺/PI⁺
- Nekrotisch: Annexin V⁻/PI⁺
Die Analyse erfolgt mittels Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie. Der Assay muss innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe von PI durchgeführt werden, da PI mit der Zeit aus den Zellen austritt.
DNA-Fragmentierung
Während der Apoptose spalten Endonukleasen (CAD/DFF40) DNA zwischen Nukleosomen und erzeugen Fragmente in 180–200 bp Vielfachen.
DNA-Leiter: Genomische DNA wird extrahiert, auf einem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Apoptotische Zellen zeigen ein charakteristisches Leitermuster von 180 bp Fragmenten. Dies ist ein qualitativer Endpunkt-Assay und relativ unempfindlich, erfordert ~10⁶ Zellen.
TUNEL (Terminale Desoxynukleotidyltransferase dUTP Nick End Labeling): TdT inkorporiert markiertes dUTP an den 3′-OH-Enden fragmentierter DNA. Die Markierung (Biotin, DIG oder Fluorophor) wird mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie detektiert. TUNEL markiert alle DNA-Brüche, einschließlich solcher in nekrotischen Zellen, daher wird es am besten mit einer morphologiebasierten Diskriminierung kombiniert.
Mitochondriales Membranpotential
Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨₘ) ist ein Kennzeichen des intrinsischen Apoptosewegs. Fluorophore, die basierend auf ihrem Membranpotential in Mitochondrien akkumulieren, werden verwendet:
- JC-1: emittiert grün (Monomer) bei niedrigem ΔΨₘ und rot (J-Aggregate) bei hohem ΔΨₘ. Das Rot/Grün-Verhältnis zeigt die mitochondriale Polarisation an.
- TMRE / TMRM: positiv geladene Farbstoffe, die in polarisierten Mitochondrien akkumulieren. Verlust der roten Fluoreszenz zeigt Depolarisation an.
Die richtigen Kontrollen
Alle Apoptose-Assays erfordern positive (z. B. 1 µM Staurosporin für 4–6 Stunden) und negative (unbehandelte) Kontrollen. Das Timing des Assays ist wichtig: Die Caspase-Aktivität erreicht ihren Höhepunkt bei 4–8 Stunden, die PS-Exposition bei 6–12 Stunden und die DNA-Fragmentierung bei 12–24 Stunden nach dem apoptotischen Stimulus.
