Apoptose-Assays
Apoptose (programmierter Zelltod) ist durch spezifische morphologische und biochemische Veränderungen gekennzeichnet. Mehrere komplementäre Tests unterscheiden Apoptose von Nekrose und identifizieren das Stadium des Zelltods.
Annexin V / Propidiumiodid-Färbung ist der gebräuchlichste durchflusszytometriebasierte Apoptose-Assay. Während der frühen Apoptose wird Phosphatidylserin (PS) von der inneren auf die äußere Seite der Plasmamembran transloziert. Annexin V, ein PS-bindendes Protein, das an einen Fluorophor (FITC, APC, PE) konjugiert ist, bindet an freiliegendes PS. Propidiumiodid (PI) oder 7-AAD gelangt nur in Zellen mit kompromittierten Membranen (späte Apoptose/Nekrose).
- Annexin V⁻ / PI⁻: lebende Zellen
- Annexin V⁺ / PI⁻: frühe apoptotische Zellen
- Annexin V⁺ / PI⁺: späte apoptotische / nekrotische Zellen
TUNEL-Assay (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling) detektiert DNA-Fragmentierung, ein Kennzeichen der späten Apoptose. Die terminale Deoxynucleotidyltransferase (TdT) fügt markiertes dUTP an die 3′-OH-Enden fragmentierter DNA an. Der Nachweis erfolgt durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie.
Caspase-Assays messen die Aktivität von Caspasen, den Exekutionsproteasen der Apoptose. Fluorogene Substrate (z. B. DEVD-AMC für Caspase-3/7) werden durch aktive Caspasen gespalten und setzen ein fluoreszierendes Signal frei. Die Caspase-3/7-Aktivität ist der am weitesten verbreitete biochemische Marker der Apoptose.
Zellzyklusanalyse
Die Zellzyklusanalyse misst die Verteilung der Zellen auf die Phasen G₀/G₁, S, G₂ und M und zeigt die Wirkung von Arzneimitteln, Nährstoffen oder genetischen Veränderungen auf die Zellteilung.
DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie verwendet einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff (PI, DAPI, Hoechst 33342). Fixierte und permeabilisierte Zellen werden gefärbt und die Fluoreszenzintensität gemessen. Die Intensität ist proportional zum DNA-Gehalt:
- G₀/G₁: 2N DNA-Gehalt (ein Peak)
- S: zwischen 2N und 4N (der Bereich zwischen den Peaks)
- G₂/M: 4N DNA-Gehalt (zweiter Peak)
Der Prozentsatz der Zellen in jeder Phase wird mit Modellierungssoftware (ModFit, FlowJo Watson-Algorithmus) berechnet.
BrdU/EdU-Puls-Chase liefert detailliertere Zellzyklusinformationen. Ein kurzer Puls von BrdU oder EdU markiert Zellen in der S-Phase. Nach einer Chase-Periode werden die Zellen sowohl auf DNA-Gehalt als auch auf BrdU/EdU-Inkorporation analysiert, was die Rate des S-Phasen-Fortschritts und die Dauer jeder Phase enthüllt.
Phospho-Histon H3 (Ser10)-Färbung markiert spezifisch mitotische Zellen und bietet einen G₂/M-Phasen-Marker, der G₂ von M mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie unterscheidet.
