ATAC-Seq ist eine Methode zur Identifizierung offener Chromatinregionen, Bereiche des Genoms, in denen DNA nicht fest um Nukleosomen gewickelt ist und für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine zugänglich ist.

Prinzip

Ein hyperaktives Derivat der Tn5-Transposase (Tn5-Transposom-Komplex) fragmentiert und markiert gleichzeitig zugängliche DNA mit Sequenzierungsadaptern in einem Prozess namens Tagmentation. Offene Chromatinregionen werden von Tn5 bevorzugt geschnitten und markiert, da nukleosomengebundene DNA physikalisch unzugänglich ist. Die markierten Fragmente werden dann per PCR amplifiziert und sequenziert.

Protokoll

1. 50.000 viable Zellen ernten (die empfohlene Mindestmenge). Für Niedrigeinsatz-Experimente können nur 500 Zellen verwendet werden.
2. Zellen in kaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,1% IGEPAL CA-630) für 10 Minuten auf Eis lysieren, um intakte Kerne zu isolieren.
3. Kerne pelletieren und in Transpositions-Reaktionsmix mit Tn5-Transposom, beladen mit Illumina-kompatiblen Adaptern, resuspendieren.
4. Bei 37 °C für 30 Minuten mit sanftem Mischen inkubieren.
5. Die tagmentierte DNA mittels Säulen- oder Bead-basierter Aufreinigung reinigen.
6. PCR-Amplifikation für 10–15 Zyklen mit Barcodierungsindizes.
7. Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform (Paired-End 50 bp ist Standard).

Datenanalyse

Rohdaten werden:

1. Von Adaptersequenzen befreit und am Referenzgenom ausgerichtet.
2. Von mitochondrialen Reads gefiltert (die 30–50% der Reads ausmachen können).
3. Auf Tn5-Insertionsbias korrigiert (Tn5 hat eine schwache Sequenzpräferenz für bestimmte Dinukleotide).
4. Peaks offenen Chromatins mit MACS2 oder Genrich bestimmt.
5. Annotation der Peaks zur Identifizierung von Promotoren, Enhancern, CTCF-Bindungsstellen und anderen regulatorischen Elementen.

Die resultierenden Peaks definieren die zugängliche Chromatinlandschaft. Differentielle Zugänglichkeit zwischen Bedingungen identifiziert regulatorische Elemente, die ihre Aktivität während Differenzierung, Krankheitsprogression oder Medikamentenbehandlung ändern.

Qualitätskontrolle

• Fragmentgrößenverteilung: Tn5 produziert Fragmente in zwei Größen. Nukleosomenfreie Fragmente sind <100 bp, mononukleosomale Fragmente sind 180–247 bp und dinukleosomale Fragmente sind 315–400 bp. Eine gute ATAC-Seq-Bibliothek zeigt ein klares Nukleosomenleiter-Muster.
• Anteil der Reads in Peaks (FRiP): Ein FRiP-Wert >0,3 zeigt ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis an.
• Transkriptionsstartstellen (TSS)-Anreicherung: Reads sollten an TSSs angereichert sein. Ein TSS-Anreicherungswert >5 zeigt gute Qualität an.

Anwendungen

ATAC-Seq wird verwendet, um regulatorische Elemente (Promotoren, Enhancer, Silencer) zu identifizieren, Transkriptionsfaktor-Footprinting zu untersuchen und Chromatindynamik über Zellzustände und Zelltypen hinweg zu profilieren. Einzelzell-ATAC-Seq (scATAC-Seq) erweitert die Methode auf einzelne Zellen und offenbart zelltypspezifische regulatorische Landschaften in heterogenen Geweben.

Vergleich mit DNase-Seq und MNase-Seq

ATAC-Seq benötigt 10–100× weniger Zellen als DNase-Seq (50.000 vs. 10–50 Millionen), dauert 1–2 Tage statt 3–4 Tage und hat einen einfacheren Arbeitsablauf (ein Enzym statt DNase-I-Titration). MNase-Seq kartiert Nukleosomenpositionen (nicht offenes Chromatin) und benötigt 10–50 Millionen Zellen. ATAC-Seq hat beide Methoden für die routinemäßige Chromatinzugänglichkeitsprofilierung weitgehend ersetzt.