Nach der Isolierung einer Reinkultur ist der nächste Schritt die Identifizierung. Traditionelle biochemische Tests beurteilen die Stoffwechselfähigkeiten, während moderne automatisierte Systeme den Prozess beschleunigen und standardisieren.

Kernbiochemische Tests

• Katalase: weist das Enzym Katalase nach, das Wasserstoffperoxid abbaut. Ein Tropfen 3% H₂O₂ auf einer Kolonie erzeugt innerhalb von Sekunden Blasen (positiv). Staphylokokken sind katalase-positiv; Streptokokken sind katalase-negativ.
• Oxidase: weist Cytochrom-c-Oxidase nach. Eine auf Filterpapier mit Oxidase-Reagenz (Tetramethyl-p-phenylendiamin) getupfte Kolonie wird innerhalb von 10–30 Sekunden dunkelviolett (positiv). Neisseria und Pseudomonas sind oxidase-positiv; Enterobacteriaceae sind oxidase-negativ.
• Koagulase: unterscheidet Staphylococcus aureus (positiv) von anderen Staphylokokken. Freie Koagulase wird durch Mischen einer Kolonie mit Kaninchenplasma und Überprüfung auf Gerinnselbildung nach 4–24 Stunden nachgewiesen.
• Indol: einige Bakterien (E. coli unter anderen) produzieren Indol aus Tryptophan. Indol reagiert mit Kovacs-Reagenz (p-Dimethylaminobenzaldehyd) unter Bildung einer roten Schicht.
• Methylrot / Voges-Proskauer (MR/VP): MR weist gemischte Säuregärung nach (rot mit Methylrot-Indikator). VP weist den Butandiol-Gärungsweg nach (pink/rot mit α-Naphthol und KOH). Klassisch für E. coli (MR⁺, VP⁻) vs. Enterobacter / Klebsiella (MR⁻, VP⁺).
• Citratverwertung: Bakterien, die Citrat als einzige Kohlenstoffquelle nutzen, produzieren Ammoniak, erhöhen den pH-Wert und schalten Bromthymolblau von grün auf blau um. Klebsiella pneumoniae ist positiv; E. coli ist negativ.
• TSI (Triple Sugar Iron)-Agar: ein Schrägagarröhrchen, das Glucose-, Laktose- und Saccharosegärung, Gasproduktion und H₂S-Produktion nachweist. Das Muster der Säure/alkalischen Reaktionen und des schwarzen Niederschlags ist charakteristisch für enterische Bakterien.

Miniaturisierte Systeme (API-Streifen)

Das API (Analytical Profile Index)-System miniaturisiert 20–50 biochemische Tests in einem Kunststoffstreifen. Jeder Test ist ein dehydriertes Substrat in einer Vertiefung. Der Streifen wird mit einer standardisierten Bakteriensuspension beimpft, 18–24 Stunden inkubiert, und die Reaktionen werden anhand von Farbänderungen abgelesen. Die resultierende 7- oder 9-stellige Profilnummer wird in einer Datenbank nachgeschlagen, um den Organismus zu identifizieren.

Automatisierte Systeme

• VITEK (bioMérieux): verwendet Kunststoffkarten mit 30–60 biochemischen Reaktionen. Eine Bakteriensuspension wird in die Karte geladen, die versiegelt und automatisch alle 15 Minuten ausgelesen wird. Die Identifizierung erfolgt in 2–8 Stunden. VITEK 2 bietet auch antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST).
• MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry): die schnellste verfügbare Identifizierungsmethode. Eine Bakterienkolonie wird auf einen Target-Platten aufgebracht, mit einer Matrix (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) überschichtet und massenspektrometrisch analysiert. Das resultierende Proteinspektrum (hauptsächlich ribosomale Proteine) wird mit einer Datenbank verglichen und liefert eine Identifizierung auf Artebene in weniger als einer Minute pro Probe.

MALDI-TOF hat biochemische Tests in klinisch-mikrobiologischen Laboren weitgehend ersetzt, aufgrund seiner Geschwindigkeit, Genauigkeit und niedrigen Verbrauchsmaterialkosten nach der Geräteanschaffung. Es identifiziert Bakterien, Hefen und Pilze aus einer einzelnen Kolonie ohne Vorwissen über den Organismus.