Transformation ist die Aufnahme und Replikation fremder DNA durch Bakterienzellen. Die meisten Laborstämme von Escherichia coli sind nicht natürlicherweise kompetent — sie müssen künstlich zur DNA-Aufnahme befähigt werden.

Herstellung kompetenter Zellen

Chemisch kompetente Zellen werden hergestellt, indem Bakterien in der logarithmischen Phase mit eiskaltem CaCl₂ (50–100 mM) gewaschen werden. Die Calciumionen neutralisieren die negativ geladene Phosphatrückgrat der DNA und die Lipopolysaccharidschicht der bakteriellen Außenmembran, was die DNA-Bindung erleichtert. Die Zellen werden aliquotiert und bei −80 °C eingefroren.

Elektrokompetente Zellen werden wiederholt in eiskaltem 10% Glycerin gewaschen, um alle Ionen aus der Suspension zu entfernen. Die niedrige Ionenstärke verhindert Lichtbögen während der Elektroporation. Die Zellen werden in einem kleinen Volumen 10% Glycerin resuspendiert, aliquotiert und eingefroren.

Chemisches Transformationsprotokoll

1. Ein Röhrchen chemisch kompetenter Zellen auf Eis auftauen (ca. 20 Minuten).
2. 1–10 µL DNA (0,1–100 ng Plasmid oder bis zu 5 µL einer Ligationsreaktion) zugeben.
3. 20–30 Minuten auf Eis inkubieren.
4. Hitzeschock bei 42 °C für genau 45 Sekunden — längere Inkubation reduziert die Viabilität.
5. Für 2 Minuten zurück auf Eis stellen.
6. 500–900 µL SOC- oder LB-Medium (ohne Antibiotikum) zugeben.
7. Bei 37 °C unter Schütteln bei 200–225 rpm für 45–60 Minuten inkubieren.
8. 50–200 µL auf selektive Agarplatten ausplattieren.
9. Über Nacht bei 37 °C inkubieren (Platten umgedreht).

Typische Effizienz: 10⁶–10⁸ KBE/µg für chemisch kompetente Zellen.

Elektroporationsprotokoll

1. Elektrokompetente Zellen auf Eis auftauen.
2. Zellen in eine gekühlte 0,1- oder 0,2-cm-Küvette überführen.
3. 1–2 µL DNA in Niedrigsalzpuffer oder Wasser zugeben (Salz verursacht Lichtbögen).
4. Elektroporation bei 1,5–2,5 kV (je nach Küvettenspaltweite), 200–400 Ω, 25 µF.
5. Sofort 500 µL SOC-Medium zugeben und resuspendieren.
6. In ein Kulturröhrchen überführen und bei 37 °C für 45–60 Minuten inkubieren.
7. Auf selektive Agarplatten ausplattieren.

Typische Effizienz: 10⁹–10¹⁰ KBE/µg für kleine Plasmide. Die Elektroporation wird für große Konstrukte (>10 kb) und Ligationsprodukte bevorzugt.

Selektion

Transformierte Zellen werden auf Agar mit einem Antibiotikum selektiert, das zum Resistenzmarker auf dem Plasmid passt. Übliche Antibiotika: Ampicillin (100 µg/mL), Kanamycin (50 µg/mL), Chloramphenicol (25 µg/mL), Tetracyclin (12,5 µg/mL). Die Ampicillin-Selektion erfordert frische Platten, da β-Lactamase diffundiert und das Antibiotikum abbaut — auf alten Platten erscheinen Satellitenkolonien.