Die Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Familie elektrokinetischer Trennmethoden, die in engen Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von 25 bis 100 Mikrometern durchgeführt werden. Ein elektrisches Feld von 100 bis 500 V/cm wird über die Kapillare angelegt und treibt geladene Analyten mit Geschwindigkeiten, die durch ihre elektrophoretische Mobilität bestimmt werden, zur entgegengesetzten Elektrode. CE vereint hohe Trenneffizienz (oft über 100.000 theoretische Böden) mit kurzen Analysezeiten, minimalem Probenverbrauch (Nanoliter) und Kompatibilität mit wässrigen und nicht-wässrigen Puffern. Sie hat sich zu einer unverzichtbaren Plattform in der pharmazeutischen Analyse, klinischen Diagnostik, Forensik, Proteomik und Metabolomik entwickelt und bietet einen orthogonalen Trennmechanismus sowohl zur Flüssigkeitschromatographie als auch zur Gelelektrophorese.
Das Prinzip der Elektrophoretischen Mobilität
Wenn ein elektrisches Feld an eine Lösung angelegt wird, erfährt ein geladenes Teilchen eine elektrostatische Kraft proportional zu seiner Nettoladung (q) und der Feldstärke (E). Das Teilchen beschleunigt, bis die Widerstandskraft des umgebenden Mediums der elektrostatischen Kraft gleicht, woraufhin es mit konstanter Geschwindigkeit wandert. Die elektrophoretische Mobilität (µ_ep) ist definiert als die Geschwindigkeit pro Feldstärkeeinheit und ist proportional zu q geteilt durch den hydrodynamischen Radius (r) des Teilchens. Kleine, stark geladene Ionen haben eine hohe Mobilität, während große oder schwach geladene Spezies langsamer wandern. Diese unterschiedliche Wanderung ist die Grundlage aller elektrophoretischen Trennungen.
Elektroosmotischer Fluss
Der elektroosmotische Fluss (EOF) ist ein charakteristisches Phänomen in der CE, das aus der elektrischen Doppelschicht an der Quarzglaskapillarwand entsteht. Bei pH-Werten über etwa 3 werden Silanolgruppen an der inneren Kapillaroberfläche deprotoniert, wodurch eine negativ geladene Wand entsteht. Kationen aus dem Puffer sammeln sich nahe der Wand an und bilden eine diffuse elektrische Doppelschicht. Wenn das elektrische Feld angelegt wird, wandern diese hydratisierten Kationen zur Kathode und ziehen die Bulklösung mit sich. Das resultierende EOF-Profil ist nahezu flach (pfropfenartig), im Gegensatz zum parabolischen Flussprofil druckgetriebener Systeme wie der HPLC. Dieser Pfropfenfluss minimiert die Zonenverbreiterung und trägt zu den außergewöhnlich hohen Trenneffizienzen bei, die in der CE beobachtet werden. Die Stärke und Richtung des EOF hängen vom pH-Wert des Puffers, der Ionenstärke und der Chemie der Kapillarwand ab und können durch Wandbeschichtungen oder dynamische Modifikatoren unterdrückt oder umgekehrt werden.
Instrumentierung
Ein CE-Instrument besteht aus einer Hochspannungs-Stromversorgung (typischerweise 0 bis 30 kV), zwei Pufferreservoiren mit Platinelektroden, einer Quarzglaskapillare (25 bis 100 cm Länge) und einem Detektor. Die Kapillare führt durch den Detektor, was eine Detektion in der Säule ohne nachgeschaltete Derivatisierungsverkabelung ermöglicht. Die Probenaufgabe erfolgt durch Ersetzen eines Pufferreservoirs mit dem Probengefäß und Anlegen von Druck (hydrodynamische Injektion) oder Spannung (elektrokinetische Injektion) für eine definierte Zeit. Die hydrodynamische Injektion wird für quantitative Arbeiten bevorzugt, da das injizierte Volumen unabhängig von der Probenmatrix ist, während die elektrokinetische Injektion eine Verzerrung zugunsten mobilerer Analyten einführt, aber eine höhere Empfindlichkeit für Spurenkomponenten erreichen kann.
Detektionsmodi
Die UV-Vis-Absorptionsdetektion ist die gebräuchlichste CE-Nachweismethode und wird typischerweise durch ein Fenster durchgeführt, das durch Entfernen der Polyimidbeschichtung von der Kapillare erzeugt wird. Die Absorption wird über den Kapillardurchmesser gemessen, was die optische Weglänge auf den Kapillarinnendurchmesser (25 bis 100 µm) begrenzt und zu einer moderaten Empfindlichkeit (niedriger mikromolarer Bereich) führt. Die laserinduzierte Fluoreszenzdetektion (LIF) bietet eine dramatisch höhere Empfindlichkeit (Attomol- bis Zeptomol-Bereich) für fluoreszenzmarkierte Analyten und ist die Methode der Wahl für DNA-Sequenzierung und Spurenanalytik. Die elektrochemische Detektion (Amperometrie und Konduktometrie) wird für elektroaktive Spezies und kleine anorganische Ionen eingesetzt. Die CE gekoppelt mit Massenspektrometrie (CE-MS) über Elektrospray-Ionisation bietet sowohl hohe Trenneffizienz als auch Strukturidentifikation und wird in der Proteomik und Metabolomik zur Analyse von Peptiden, Proteinen und polaren Metaboliten häufig eingesetzt.
Die Trennmodi
CE umfasst mehrere Betriebsmodi, die unterschiedliche Trennmechanismen nutzen. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) trennt Analyten basierend auf ihrem Ladungs-Größen-Verhältnis in freier Lösung und ist der am weitesten verbreitete Modus. Die Kapillargelelektrophorese (CGE) verwendet ein Polymergel oder eine lineare Polymermatrix, um Moleküle nach Größe zu trennen, und ist die Standardplattform für DNA-Sequenzierung und forensische DNA-Profilierung. Die Kapillar-Isoelektrische Fokussierung (CIEF) trennt amphotere Moleküle wie Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) in einem pH-Gradienten. Die Kapillar-Isotachophorese (CITP) verwendet ein diskontinuierliches Puffersystem, um Analyten in scharfen, konzentrierten Zonen zu fokussieren, und wird oft zur Probenvorkonzentrierung vor der CZE eingesetzt. Die Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) führt Tensidmizellen als pseudostationäre Phase ein und ermöglicht die Trennung neutraler Analyten durch hydrophobe Verteilung. Die Wahl des Modus hängt von der Art der Analyten und den Trennzielen ab.
Vergleich mit der HPLC
CE und HPLC sind komplementäre Trenntechniken. Die HPLC trennt Analyten basierend auf der Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase, während die CE auf Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität in freier Lösung basiert. Die CE bietet typischerweise höhere Trennstufenzahlen (100.000 bis 500.000 Böden pro Meter) als die HPLC, jedoch eine geringere Konzentrationsempfindlichkeit aufgrund der kurzen optischen Weglänge und der kleinen Injektionsvolumina. Die CE ist besonders vorteilhaft für geladene, polare und ionische Spezies, die auf RP-HPLC-Säulen schwer zurückzuhalten sind. Die Methodenentwicklung in der CE wird durch die große Auswahl an Trennmodi und die Möglichkeit, die Selektivität durch Pufferzusammensetzung, pH-Wert und Additive zu beeinflussen, vereinfacht, ohne dass Säulen gewechselt werden müssen.
