Die Kapillar-Isotachophorese (CITP) ist eine spezialisierte elektrophoretische Trenntechnik, die ein diskontinuierliches Puffersystem bestehend aus einem Leitelektrolyten (LE) und einem Terminationselektrolyten (TE) verwendet, um geladene Analyten in scharf abgegrenzte, zusammenhängende Zonen zu fokussieren. Alle Analytenzonen migrieren mit derselben Geschwindigkeit, die durch das Leit-ion bestimmt wird, ein Zustand, der als isotachophoretischer Zustand bezeichnet wird. CITP bietet einzigartige Möglichkeiten zur Probenkonzentrierung, Reinigung und Vorkonzentrierung vor der nachgeschalteten Analyse und ist besonders wertvoll für die Spurenanreicherung ionischer Analyten aus verdünnten Proben. Im Gegensatz zur Zonenelektrophorese, bei der Analyten in diskrete Zonen aufgetrennt werden, die mit der Zeit verbreitern, komprimiert die Isotachophorese schmale Zonen und hält sie während der gesamten Trennung aufrecht, was hohe lokale Analytenkonzentrationen ergibt, die die Nachweisempfindlichkeit verbessern.

Das diskontinuierliche Puffersystem

Die grundlegende Voraussetzung für die Isotachophorese ist die Verwendung von zwei Puffersystemen, die ein gemeinsames Gegenion teilen, sich aber in ihrer effektiven Mobilität unterscheiden. Der Leitelektrolyt enthält ein Ion mit der höchsten effektiven Mobilität aller ionischen Spezies im System, während der Terminationselektrolyt ein Ion mit der niedrigsten effektiven Mobilität enthält. Die Probe wird zwischen diese beiden Elektrolyte eingebracht. Wenn das elektrische Feld angelegt wird, bewegt sich das Leit-ion am schnellsten und bestimmt die Migrationsgeschwindigkeit für das gesamte System. Ionen mit mittleren Mobilitäten ordnen sich in absteigender Reihenfolge der Mobilität zwischen den Leit- und Terminationszonen an. Alle Zonen migrieren dann mit derselben Geschwindigkeit, die durch das Leit-ion bestimmt wird, und bleiben ohne Lücken in Kontakt miteinander. Die Konzentration jedes Analyten passt sich automatisch gemäß der Kohlrausch-Regulierungsfunktion an, die besagt, dass das Produkt aus Konzentration und Mobilität unter stationären Bedingungen innerhalb jeder Zone konstant ist.

Fokussiermechanismus und Zonenschärfung

Der selbstschärfende Effekt ist das bestimmende Merkmal der Isotachophorese. Wenn ein Analytenion in eine benachbarte Zone diffundiert, in der das elektrische Feld unterschiedlich ist, erfährt es eine Kraft, die es in seine eigene Zone zurückführt. Ionen, die in eine Zone höherer Feldstärke abweichen, beschleunigen, bis sie wieder in ihre korrekte Zone eintreten, während solche, die in eine Zone niedrigerer Feldstärke eintreten, verlangsamen. Diese dynamische Fokussierung wirkt der Diffusion entgegen und erzeugt außergewöhnlich scharfe Zonengrenzen. Die Konzentration des Analyten innerhalb jeder Zone wird durch die Konzentration und Mobilität des Leit-ions bestimmt, nicht durch die anfängliche Probenkonzentration. Diese einzigartige Eigenschaft ermöglicht es CITP, Analyten um das 100- bis 1000-fache oder mehr zu konzentrieren, was sie zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Spurenanalyse macht.

Instrumentierung und praktische Überlegungen

CITP kann in derselben Kapillarelektrophorese-Instrumentierung durchgeführt werden, die auch für andere Trennmodi verwendet wird, sofern das System die diskontinuierliche Pufferkonfiguration unterstützen kann. Eine Kapillare aus Quarzglas wird mit dem Leitelektrolyten gefüllt, gefolgt von der Injektion der Probe und dann der Einführung des Terminationselektrolyten am Einlassreservoir. Eine Konstantstrom-Stromversorgung wird typischerweise gegenüber einem Konstantspannungsbetrieb bevorzugt, da der Strom während der Trennung stabil bleibt, während die Spannung sich ändert, wenn Zonen unterschiedlicher Leitfähigkeit die Kapillare passieren. Die Detektion erfolgt üblicherweise mit Leitfähigkeitsdetektoren, die auf Änderungen der Zonenleitfähigkeit ansprechen, oder UV-Vis-Absorptionsdetektoren, die am Kapillarausgang positioniert sind. Die Bildung stabiler, reproduzierbarer Zonen erfordert eine sorgfältige Auswahl der Zusammensetzung von Leit- und Terminationselektrolyt, einschließlich der Wahl des Gegenions, des pH-Werts und des Zusatzes von Komplexbildnern oder organischen Lösungsmitteln zur Anpassung der Selektivität.

Kopplung mit der Kapillarzonenelektrophorese

Eine der wichtigsten Anwendungen von CITP ist als online Vorkonzentrierungsschritt vor der Kapillarzonenelektrophorese (CZE). In einer gekoppelten CITP-CZE-Konfiguration wird das erste Segment der Kapillare für die isotachophoretische Fokussierung eines großen Probenvolumens verwendet, während das zweite Segment die zonenelektrophoretische Trennung der fokussierten Analytenbanden durchführt. Ein Leitfähigkeits- oder Spannungsschalter wird verwendet, um die gestapelten Zonen von der CITP-Stufe in die CZE-Stufe zu überführen. Dieser Ansatz kann die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zur konventionellen CZE-Injektion um zwei bis drei Größenordnungen verbessern und ermöglicht den Nachweis von Spurenkomponenten im nanomolaren Bereich. Die hybride CITP-CZE-Technik wurde auf die Analyse von Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, pharmazeutischen Verunreinigungen, Umweltkontaminanten und Lebensmittelzusatzstoffen angewendet.

Anwendungen in der Bioanalytik

CITP findet umfangreiche Anwendung im bioanalytischen Bereich zur Vorkonzentrierung und Reinigung komplexer biologischer Proben. In der Proteomik wird CITP eingesetzt, um verdünnte Proteinhydrolysate zu konzentrieren und hochabundante Salze und Puffer zu entfernen, die den massenspektrometrischen Nachweis stören würden. Die Technik wurde in Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS)-Workflows integriert, um den Nachweis niedrigabundanter Peptide und posttranslationaler Modifikationen zu verbessern. In der klinischen Chemie wird CITP zur Bestimmung organischer Säuren im Urin, zur Überwachung von Arzneimittelmetaboliten im Plasma und zum Screening auf angeborene Stoffwechselstörungen eingesetzt. Die Fähigkeit, große Injektionsvolumina ohne Auflösungsverlust zu verarbeiten, macht CITP besonders geeignet für Proben, bei denen die Zielanalyten in Spurenkonzentrationen innerhalb einer komplexen Matrix vorliegen.

Aktuelle Trends und zukünftige Richtungen

Jüngste Entwicklungen in der CITP umfassen die Miniaturisierung auf mikrofluidischen Chips, bei denen die isotachophoretische Fokussierung zur Konzentrierung von Analyten in Mikrokanalnetzwerken für die Integration in Lab-on-a-Chip-Geräte verwendet wird. Fortschritte im Elektrolytdesign, einschließlich der Verwendung von zwitterionischen Puffern und nichtwässrigen Lösungsmittelsystemen, haben das Spektrum der für die isotachophoretische Analyse geeigneten Analyten erweitert. Die rechnergestützte Modellierung des isotachophoretischen Prozesses ermöglicht nun die rationale Optimierung von Pufferzusammensetzungen und Trennbedingungen. CITP entwickelt sich weiterhin als komplementäre Technik innerhalb des breiteren Kapillarelektrophorese-Werkzeugkastens, geschätzt für ihre einzigartige Konzentrierungskraft und ihre Fähigkeit, anspruchsvolle Probenmatrices zu handhaben, die in der Umweltüberwachung, Lebensmittelsicherheit, pharmazeutischen Entwicklung und klinischen Diagnostik vorkommen.