Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist die grundlegendste und am weitesten verbreitete Betriebsart der Kapillarelektrophorese. Bei der CZE wird die Kapillare mit einem kontinuierlichen, gleichmäßigen Hintergrundelektrolyten (BGE) gefüllt, und die Probe wird als schmaler Pfropfen am Einlassende eingeführt. Unter dem Einfluss des angelegten elektrischen Feldes wandert jeder Analyt mit seiner charakteristischen Geschwindigkeit, die durch die Summe seiner elektrophoretischen Mobilität und des elektroosmotischen Flusses (EOF) bestimmt wird. Analyten, die sich in Ladung oder Größe unterscheiden, wandern mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und werden beim Transport zum Detektor in diskrete Zonen aufgetrennt. Die CZE wird auf eine breite Palette von Analyten angewendet, von kleinen anorganischen Ionen und Pharmazeutika bis hin zu Peptiden, Proteinen und Nucleinsäurefragmenten.
Der Mechanismus der Zonentrennung
Die Nettowanderungsgeschwindigkeit eines Analyten in der CZE ist die Vektorsumme seiner elektrophoretischen Geschwindigkeit (zur entgegengesetzt geladenen Elektrode) und der elektroosmotischen Geschwindigkeit (normalerweise zur Kathode). Bei pH-Werten über 3 ist der EOF im Allgemeinen stärker als die elektrophoretische Mobilität der meisten Anionen, sodass alle Analyten — Kationen, Neutrale und Anionen — zum Detektor am Kathodenende gespült werden. Kationen wandern am schnellsten, da ihre elektrophoretische Wanderung in die gleiche Richtung wie der EOF erfolgt. Neutrale Analyten wandern mit der EOF-Geschwindigkeit und coeluieren als einzelner nicht aufgelöster Peak, weshalb CZE ohne Modifikation nicht für neutrale Spezies geeignet ist. Anionen wandern am langsamsten, da ihre elektrophoretische Wanderung dem EOF entgegenwirkt, und solche mit Mobilitäten größer als der EOF in die entgegengesetzte Richtung erreichen den Detektor nie. Das Trennfenster wird durch die Wanderungszeit eines neutralen Markers (t_EOF) und die Zeit definiert, zu der das langsamste Anion erscheint.
Pufferzusammensetzung und Selektivität
Die Wahl des BGE ist das wirksamste Mittel zur Steuerung der Selektivität in der CZE. Der pH-Wert des Puffers bestimmt den Ionisationszustand von sauren und basischen Analyten und damit ihre effektive Ladung und Mobilität. Bei Peptid- und Proteintrennungen wird der pH-Wert auf einen Wert eingestellt, bei dem die interessierenden Spezies deutlich unterschiedliche Nettoladungen aufweisen, typischerweise im Bereich von 2 bis 9. Die Ionenstärke des Puffers beeinflusst sowohl die EOF-Größe als auch die Dicke der elektrischen Doppelschicht; eine höhere Ionenstärke reduziert den EOF und komprimiert die Doppelschicht, was die Auflösung verbessert, aber den Strom und die Joulesche Erwärmung erhöht. Organische Lösungsmittel wie Acetonitril oder Methanol können dem BGE zugesetzt werden, um die Löslichkeit der Analyten zu verändern, die Dielektrizitätskonstante zu ändern und den EOF zu modifizieren. Chirale Trennungen werden durch Zugabe von Cyclodextrinen oder anderen chiralen Selektoren zum BGE erreicht, die vorübergehende diastereomere Komplexe mit Enantiomeren bilden.
Theoretische Böden und Auflösung
CZE-Trennungen zeichnen sich durch extrem hohe Bodenzahlen aus, die oft 200.000 Böden pro Meter überschreiten. Die Zonenverbreiterung in der CZE wird durch Längsdiffusion dominiert, da das flache EOF-Profil die strömungsinduzierte Verbreiterung eliminiert, die die HPLC-Effizienz begrenzt. Die Anzahl der theoretischen Böden (N) ergibt sich aus N = (µ_app V) / (2 D), wobei µ_app die scheinbare Mobilität, V die angelegte Spannung und D der Diffusionskoeffizient ist. Die Auflösung zwischen zwei Peaks hängt vom Unterschied ihrer scheinbaren Mobilitäten, der durchschnittlichen Bodenzahl und der elektroosmotischen Geschwindigkeit ab. Die Auflösung kann durch Erhöhen der angelegten Spannung (bis zur Grenze der Jouleschen Erwärmung), Verlängern der effektiven Kapillarlänge, Verringern des EOF (durch Erniedrigen des pH-Werts oder Verwendung beschichteter Kapillaren) oder Optimieren der Pufferzusammensetzung zur Maximierung des Mobilitätsunterschieds zwischen Analyten verbessert werden.
Probenstacking für verbesserte Empfindlichkeit
Die Konzentrationsempfindlichkeit der CZE mit UV-Absorptionsdetektion ist durch die kurze optische Weglänge und das kleine Injektionsvolumen (typischerweise 1 bis 20 nL) begrenzt. On-Capillary-Vorkonzentrationstechniken, die zusammen als Stacking bezeichnet werden, verbessern die Empfindlichkeit dramatisch, indem sie die Probenzone vor Beginn der Trennung konzentrieren. Das field-amplified sample stacking (FASS) nutzt den Unterschied in der Leitfähigkeit zwischen der Probenmatrix (niedrige Leitfähigkeit) und dem BGE (hohe Leitfähigkeit). Wenn Spannung angelegt wird, bewirkt das höhere elektrische Feld in der Probenzone mit niedriger Leitfähigkeit, dass die Analytionen schnell wandern, bis sie die BGE-Grenze erreichen, wo sie verlangsamt werden und sich in einem schmalen Band ansammeln. Sweeping verwendet pseudostationäre Phasen wie Micellen, um neutrale oder geladene Analyten einzufangen und zu fokussieren. Die transiente Isotachophorese (tITP) verwendet ein System aus Leit- und Terminierungselektrolyten, um Analyten in scharfen Zonen zu fokussieren, ähnlich der Kapillarisotachophorese, bevor zur CZE-Trennung übergegangen wird. Diese Stacking-Methoden können eine 10- bis 1000-fache Empfindlichkeitssteigerung bewirken und die UV-Nachweisgrenzen in den niedrigen nanomolaren Bereich bringen.
Anwendungen im klinischen Labor
Die CZE wird in klinischen Laboren weitgehend zur Serumproteinanalyse eingesetzt, wo sie die Agarose-Gelelektrophorese für die routinemäßige Serumproteinelektrophorese (SPEP) weitgehend abgelöst hat. Serumproteine trennen sich in fünf Hauptfraktionen — Albumin, Alpha-1, Alpha-2, Beta- und Gamma-Globuline — und das Elektropherogramm wird auf monoklonale Gammopathien, Entzündungsmuster und Proteinmängel untersucht. Die CZE ist auch die Methode der Wahl für das Hämoglobinopathie-Screening, bei dem Hämoglobinvarianten wie HbA, HbF, HbS und HbC bei alkalischem pH-Wert getrennt werden. In der pharmazeutischen Analyse wird die CZE für die Reinheitsprüfung von Arzneimitteln, die Gegenionenbestimmung und die chirale Reinheitsprofilierung eingesetzt. In der Proteomik bietet die CZE gekoppelt mit Massenspektrometrie (CZE-MS/MS) eine hocheffiziente Peptidtrennung für die Bottom-Up-Proteinidentifizierung, die besonders vorteilhaft für Proben mit geringem Volumen und basische Peptide ist, die für die RP-LC-MS eine Herausforderung darstellen.
Methodenentwicklungsaspekte
Die Entwicklung einer CZE-Methode beginnt mit der Auswahl des BGE-pH-Werts basierend auf den pKa-Werten der Analyten. Ein Phosphat- oder Boratpuffer bei pH 2,5 ist ein üblicher Ausgangspunkt für kleine Moleküle und Peptide. Die Kapillarabmessungen (Länge, Innendurchmesser) und die angelegte Spannung werden so gewählt, dass Analysengeschwindigkeit und Auflösung ausbalanciert sind. Die Säulentemperatur wird durch Umluft- oder Flüssigkeitskühlung kontrolliert, um die Joulesche Wärme abzuleiten, und die Kapillare wird zwischen den Läufen mit Natriumhydroxid, Wasser und BGE gespült, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten. Für quantitative Analysen wird ein interner Standard hinzugefügt, um die Variabilität des Injektionsvolumens zu korrigieren, und die Methode wird gemäß den ICH-Richtlinien auf Linearität, Präzision, Richtigkeit und Robustheit validiert.
