Zu wissen, wie viele lebende Zellen Sie haben und wie schnell sie sich teilen, ist entscheidend für reproduzierbare Zellkultur- und Pharmakologieexperimente.

Hämozytometer-Zählung

Das Hämozytometer ist ein spezialisierter Mikroskop-Objektträger mit zwei eingeätzten Zählkammern, die jeweils ein Raster mit bekannten Abmessungen enthalten. Das Raster besteht aus neun 1 × 1 mm Quadraten, die jeweils in 16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Die Tiefe beträgt 0,1 mm, was ein Volumen von 0,1 µL pro 1 mm²-Quadrat ergibt.

1. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich, um Einzelzellen zu erhalten.
2. Mischen Sie 10 µL Zellsuspension mit 10 µL 0,4% Trypanblau (für Viabilität).
3. Laden Sie 10 µL des Gemischs in die Hämozytometerkammer.
4. Zählen Sie die Zellen in den vier Eck-1 mm²-Quadraten (mindestens 100 Zellen insgesamt für statistische Signifikanz).
5. Berechnen Sie: Zellen/mL = (durchschnittliche Anzahl pro Quadrat) × Verdünnungsfaktor × 10⁴.

Trypanblau-Ausschluss

Trypanblau wird von lebenden Zellen mit intakten Membranen ausgeschlossen, gelangt aber in tote Zellen und färbt sie blau. Viabilität = (lebende Zellen / Gesamtzellen) × 100 %. Akzeptable Viabilität für die meisten Experimente beträgt >90 %.

Automatisierte Zellzähler

Automatisierte Zähler (Countess, Vi-CELL, Cellometer) verwenden Trypanblau und digitale Bildanalyse, um hunderte Zellen in Sekunden zu zählen. Sie reduzieren die Variabilität zwischen verschiedenen Anwendern und liefern Daten zur Größenverteilung. Die meisten berechnen auch die Viabilität und können Zellklumpen erkennen. Kalibrieren Sie automatisierte Zähler regelmäßig gegen manuelle Hämozytometer-Zählungen.

Viabilitäts- und Zytotoxizitätsassays

Über Trypanblau hinaus beurteilen mehrere plattenbasierte Tests die Viabilität und Zytotoxizität in Multivell-Formaten:

• MTT/MTS-Assay: mitochondriale Dehydrogenasen in lebenden Zellen reduzieren den Tetrazoliumfarbstoff zu einem farbigen Formazan (Absorption bei 490–570 nm). Das Signal ist proportional zur Anzahl metabolisch aktiver Zellen.
• Resazurin (Alamar Blue): lebende Zellen reduzieren Resazurin zu fluoreszierendem Resorufin. Nicht toxisch — dieselben Zellen können über Zeit gemessen werden.
• LDH-Freisetzungsassay: Laktatdehydrogenase, die aus geschädigten Zellen in das Medium freigesetzt wird, wird enzymatisch gemessen (Absorption bei 490 nm). Misst direkt die Zytotoxizität.
• ATP-Assay (CellTiter-Glo): Luciferase-basierte Messung von zellulärem ATP. Extrem empfindlich und linear über einen weiten dynamischen Bereich.

Proliferationsassays

• Wachstumskurve: Zählen Sie Zellen täglich über 5–7 Tage und plotten Sie die log-Zellzahl gegen die Zeit. Die Verdopplungszeit wird aus der exponentiellen Phase berechnet.
• BrdU/EdU-Inkorporation: Nukleosidanaloga, die während der S-Phase in DNA eingebaut werden, werden durch Antikörperfärbung (BrdU) oder Click-Chemie (EdU) nachgewiesen. Gemessen mittels Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder ELISA.
• SRB-Assay (Sulforhodamin B): färbt zelluläres Protein. Fixierte Zellen werden mit SRB gefärbt, der gebundene Farbstoff wird solubilisiert und bei 510 nm gemessen. Hervorragende Linearität und Stabilität.