Zellkultur ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung der Zellphysiologie, zur Produktion rekombinanter Proteine, zum Testen von Arzneimittelkandidaten und zur Herstellung von Zelltherapien. Der Erfolg hängt von aseptischer Technik, geeigneten Medien und kontrollierten Umgebungsbedingungen ab.

Biosicherheit und aseptische Technik

Die gesamte Zellkulturarbeit wird in einer Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) unter Verwendung steriler Technik durchgeführt. Die BSC schützt sowohl den Benutzer als auch die Kultur, indem sie die Luft durch einen HEPA-Filter filtert und eine abwärts gerichtete laminare Luftströmung erzeugt.

Wichtige aseptische Praktiken:

• Sprühen Sie alle Gegenstände mit 70% Ethanol ein, bevor Sie sie in die BSC stellen.
• Blockieren Sie nicht die Luftgitter an der Vorder- oder Rückseite der Werkbank.
• Arbeiten Sie von sauber zu schmutzig — ordnen Sie Reagenzien auf einer Seite und Abfall auf der anderen an.
• Berühren Sie niemals die Innenseite eines Deckels oder den Rand einer sterilen Flasche.
• Wechseln Sie die Handschuhe nach dem Umgang mit nicht sterilen Gegenständen.

Wachstumsmedien

Die meisten Säugetierzellen werden in komplexen Medien kultiviert, die Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und ein pH-Puffersystem liefern. Gebräuchliche Formulierungen:

• DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium): hoher Glucosegehalt (4,5 g/L) oder niedriger Glucosegehalt (1 g/L). Verwendet für HeLa, HEK 293, Fibroblasten.
• RPMI-1640: entwickelt für Suspensionszellen und Lymphozyten. Häufig verwendet für hämatopoetische Zellen und Hybridome.
• F-12 / Ham’s F-12: reichhaltiges Medium für serumfreies Klonen und CHO-Zellen.
• FBS (fötales Kälberserum): wird bei 5–20 % (typischerweise 10 %) zugesetzt, um Wachstumsfaktoren, Hormone und Adhäsionsfaktoren bereitzustellen. Chargenvariabilität kann die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen — testen und reservieren Sie eine konsistente Charge.

Umgebungskontrolle

Säugetierzellen werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ in Luft inkubiert. Das CO₂ löst sich im Medium und bildet Kohlensäure, die zusammen mit dem Bicarbonatpuffersystem den pH-Wert bei ~7,4 hält. Die Befeuchterpfanne des Inkubators sollte mit sterilem Wasser gefüllt und regelmäßig gereinigt werden, um Schimmel- und Bakterienwachstum zu verhindern.

Zelltypen

• Adhärente Zellen: heften sich an das Kulturgefäß (z. B. HeLa, HEK 293, MDCK, primäre Fibroblasten). Erfordern Trypsinierung für die Passagierung.
• Suspensionszellen: wachsen frei schwebend im Medium (z. B. Jurkat, HL-60, viele Hybridome). Passagiert durch Verdünnung mit frischem Medium.
• Primäre Zellen: direkt aus Gewebe isoliert. Haben eine begrenzte Lebensdauer (Hayflick-Grenze). Physiologisch relevanter, aber schwieriger zu kultivieren.
• Immortalisierte Zelllinien: aus Tumoren gewonnen oder in vitro transformiert. Können unbegrenzt passagiert werden, können aber genetisch vom ursprünglichen Gewebe abweichen.

Passagieren (Subkultivierung)

Adhärente Zellen werden passagiert, wenn sie 70–90 % Konfluenz erreicht haben. Das Standardprotokoll: Medium entfernen, mit PBS (Ca²⁺/Mg²⁺-frei) waschen, Trypsin-EDTA zugeben, bei 37 °C für 2–5 Minuten inkubieren, bis sich die Zellen ablösen, frisches Medium zur Neutralisierung des Trypsins zugeben, zählen und in der entsprechenden Dichte neu aussäen.

Notieren Sie die Passagenzahl jedes Mal. Zellen sollten innerhalb eines definierten Passagenfensters (z. B. Passagen 3–20 für die meisten immortalisierten Linien) verwendet werden, um phänotypische Drift zu minimieren.