Die Zellzyklusanalyse quantifiziert den Anteil der Zellen in jeder Phase des Zellteilungszyklus. Die häufigsten Methoden messen den DNA-Gehalt mittels Durchflusszytometrie.

DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie

Zellen werden fixiert und permeabilisiert, dann mit einem stöchiometrischen DNA-Farbstoff gefärbt. Die Fluoreszenzintensität ist proportional zum DNA-Gehalt:

• G0/G1: diploider (2N) DNA-Gehalt.
• S-Phase: DNA-Gehalt zwischen 2N und 4N (laufende DNA-Synthese).
• G2/M: tetraploider (4N) DNA-Gehalt.

Die Grundannahme ist, dass der Farbstoff DNA direkt proportional zur Masse bindet. Propidiumiodid (PI) ist der häufigste DNA-Farbstoff für fixierte Zellen, bindet aber auch RNA. Ein RNase-A- oder RNase-T1-Behandlungsschritt ist daher essentiell.

Propidiumiodid-Protokoll:

1. 1×10⁶ Zellen ernten und mit PBS waschen.
2. In 70% Ethanol bei −20 °C für mindestens 2 Stunden fixieren (kann Wochen gelagert werden).
3. Mit PBS waschen, um Ethanol zu entfernen (während des Waschens vortexen, um Verklumpung zu verhindern).
4. In PI/RNase-Färbepuffer resuspendieren (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A in PBS, 0,1% Triton X-100).
5. Bei 37 °C für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
6. Mittels Durchflusszytometrie analysieren (lineare Skala, 488 nm Anregung, >575 nm Emission).
7. Mindestens 10.000 Ereignisse bei niedriger Durchflussrate (wenige Ereignisse/Sekunde) für beste CV sammeln.

Datenanalyse

Das DNA-Gehalts-Histogramm zeigt Peaks bei 2N und 4N mit einem S-Phasen-Plateau dazwischen. Modellierungssoftware (FlowJo, ModFit, FCS Express) passt ein mathematisches Modell an die Daten an:

• Die G0/G1- und G2/M-Peaks werden als Gauß-Verteilungen modelliert (CV = 2–5% für hochwertige Daten).
• Die S-Phase wird als breites Rechteck oder Polynom mit einer steigenden Steigung von 2N zu 4N modelliert.
• Debris und Aggregate werden durch eine Debris-Kurve (exponentiell) und Aggregat-Peaks (bei 6N, 8N usw.) modelliert.

Ein CV >8% am G0/G1-Peak weist auf schlechte Datenqualität hin, Zellklumpen, unvollständige RNase-Behandlung oder zu hohe Durchflussrate.

BrdU-Inkorporation

Bromdesoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidin-Analogon, das während der S-Phase in DNA eingebaut wird. Nach der Markierung (30–60 Minuten) werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit einem Anti-BrdU-Antikörper gefärbt. Die DNA wird mit 7-AAD oder DAPI gegengefärbt. Die Durchflusszytometrie mit dualer Parameteranalyse (BrdU vs. DNA-Gehalt) unterscheidet:

• G0/G1: niedriges BrdU, 2N DNA.
• S-Phase: hohes BrdU, intermediate DNA.
• G2/M: niedriges BrdU, 4N DNA.
• G0: sehr niedriges BrdU, 2N DNA (verlängertes G0 kann von G1 durch Ki-67-Färbung unterschieden werden).

Die BrdU-Färbung erfordert eine partielle DNA-Denaturierung (HCl oder DNase I), um das inkorporierte BrdU dem Antikörper zugänglich zu machen, was die DNA-Integrität beeinträchtigt und das DNA-Gehalts-Histogramm verbreitern kann. EdU, ein BrdU-Analogon das durch kupferkatalysierte Klick-Chemie detektiert wird, vermeidet den Denaturierungsschritt und erhält die hochwertige DNA-Gehaltsanalyse.

Mitotischer Index

Zellen in der Mitose (M-Phase) können durch Färbung auf phosphoryliertes Histon H3 an Ser10 (p-H3S10) identifiziert werden. Diese Modifikation ist spezifisch für mitotische Zellen. In Kombination mit der DNA-Gehaltsanalyse ermöglicht die p-H3S10-Färbung die Unterscheidung mitotischer Zellen von der breiteren G2/M-Population.

Häufige Fallstricke

• Dubletten: Zwei G1-Zellen, die gemeinsam den Laser passieren, werden als einzelnes G2/M-Ereignis registriert. Verwenden Sie eine Dubletten-Diskriminierungsgate (FL2-A vs. FL2-W), um sie auszuschließen.
• Hypodiploide (sub-G1) Population: Zellen mit <2N DNA-Gehalt sind apoptotisch oder nekrotisch. Wenn >10% der Ereignisse sub-G1 sind, könnten die Kulturbedingungen Zelltod induzieren.
• Fixierung: Methanol-Fixierung liefert eine bessere DNA-Gehaltsauflösung als Ethanol, ist aber nicht mit allen Zelloberflächenmarkern kompatibel.