Zellmigration ist essenziell für die Embryonalentwicklung, Wundheilung und Immunantworten. Invasion erweitert die Migration um den aktiven Abbau der extrazellulären Matrix (ECM). Diese Tests sind entscheidend in der Krebsforschung, Angiogenesestudien und Arzneimittelentwicklung.

Der Scratch- (Wundheilungs-) Assay

Der Scratch-Assay ist der einfachste und kostengünstigste Migrationsassay. Ein konfluenter Monolayer wird mit einer Pipettenspitze geritzt, um eine zellfreie Zone zu schaffen, und die Rate, mit der Zellen in die Lücke migrieren, wird über die Zeit gemessen.

Protokoll:

1. Züchten Sie Zellen bis zu 100 % Konfluenz in einer 12- oder 24-Well-Platte.
2. Entziehen Sie das Serum über Nacht, um die Proliferation zu unterdrücken.
3. Ritzen Sie den Monolayer mit einer 200 µL Pipettenspitze oder einem speziellen Wundwerkzeug.
4. Waschen Sie mit PBS, um abgelöste Zellen zu entfernen.
5. Fügen Sie Medium mit 0,5–2 % Serum hinzu (um die Proliferation zu minimieren).
6. Bildgeben Sie den Scratch in Intervallen (0, 6, 12, 24 Stunden) mit einem Phasenkontrastmikroskop.
7. Messen Sie die Wundfläche mit ImageJ oder einem automatisierten Analysetool.

Die Daten werden als % Wundverschluss oder Verschlussrate ausgedrückt. Der Assay ist einfach, aber durch die Variabilität manueller Kratzer und den störenden Effekt der Proliferation am Wundrand begrenzt.

Transwell- (Boyden-Kammer-) Assay

Der Transwell-Assay verwendet ein Zweikammersystem, das durch eine poröse Membran getrennt ist (typischerweise 8 µm Poren für die meisten Zelltypen, 3 µm für kleine Zellen wie Lymphozyten). Zellen werden in die obere Kammer gegeben, und ein Chemoattraktant (z. B. 10 % FBS, spezifisches Chemokin) wird in die untere Kammer gegeben. Zellen, die durch die Poren migrieren, werden fixiert, gefärbt (Kristallviolett, DAPI) und gezählt.

Für Invasionsassays wird die Oberseite der Membran mit einer dünnen Schicht Matrigel, einem Basalmembranextrakt, beschichtet. Zellen müssen die ECM-Barriere abbauen, bevor sie durch die Poren migrieren, was die physiologische Invasion genauer nachahmt als Migration allein.

Quantifizierungsoptionen:

• Manuelles Zählen gefärbter Zellen auf der Membranunterseite (5–10 Felder pro Well).
• Lösen des Farbstoffs und Messen der Absorption (OD 560–590 nm).
• Vorabmarkieren der Zellen mit Calcein AM und Messen der Fluoreszenz migrierter Zellen.

Echtzeit-Zellanalyse

Markenfreie Instrumente wie das xCELLigence verwenden Mikroelektroden am Boden einer speziellen Platte, um die elektrische Impedanz zu messen. Wenn Zellen aus dem oberen Well durch eine Membran migrieren, heften sie sich an die Mikroelektrodenoberfläche auf der unteren Seite, was das Impedanzsignal erhöht. Dies liefert kontinuierliche Echtzeit-Migrationsdaten ohne Färbung oder Endpunktfixierung.

Wichtige Überlegungen

• Serumgradient: ein Konzentrationsgradient über die Membran hinweg ermöglicht gerichtete Migration. Ohne Gradienten wird zufällige (chemokinetische) Bewegung gemessen.
• Matrixbeschichtung: für Invasion beeinflussen die Membranporengröße, die Matrixzusammensetzung (Matrigel, Kollagen I, Fibronektin) und die Beschichtungsdicke die Ergebnisse.
• Zelldichte: zu wenige Zellen ergeben schlechte Zählungen; zu viele verursachen Aggregation und verstopfte Poren. Optimieren Sie die Dichte für jeden Zelltyp.
• Zeitverlauf: Migration durch 8 µm Poren dauert typischerweise 6–24 Stunden, abhängig vom Zelltyp.