Zellsynchronisation ist der Prozess, alle Zellen einer Kultur in dieselbe Phase des Zellzyklus zu bringen. Sie ermöglicht Zellzyklus-abhängige Studien ohne Einzelzell-Auflösungsmethoden.

Chemische Methoden

Thymidinblock. Überschüssiges Thymidin (2 mM) hemmt die Ribonukleotidreduktase, erschöpft den dCTP-Pool und stoppt die DNA-Synthese. Zellen akkumulieren an der G1/S-Grenze. Ein einzelner Block arretiert die meisten Zellen innerhalb von 12–24 Stunden an G1/S. Ein Doppel-Thymidinblock (Block 16–18 Stunden, Freisetzung 8–10 Stunden, erneuter Block 16–18 Stunden) erreicht >90 % Synchronisation an G1/S. Der zweite Block fängt Zellen, die während der ersten Freisetzung die S-Phase durchlaufen haben.

Die Freisetzung erfolgt durch Auswaschen des Thymidins mit frischem Medium. Nach der Freisetzung bewegt sich die Population synchron durch die S-, G2- und M-Phasen. Die Synchronität nimmt mit jedem Zellzyklus aufgrund natürlicher Variationen in den Zellzyklus-Fortschrittsraten ab.

Hydroxyharnstoff. Hemmt die Ribonukleotidreduktase ähnlich wie Thymidin. Wird bei 1–2 mM für 12–24 Stunden verwendet. Hydroxyharnstoff ist weniger toxisch als Thymidin und arretiert Zellen an der G1/S-Grenze mit guter Reversibilität. Der Hauptnachteil ist, dass er DNA-Schäden (Replikationsstress) verursacht, was Experimente zur Untersuchung von DNA-Schadensantworten beeinträchtigen kann.

Nocodazol. Depolymerisiert Mikrotubuli und arretiert Zellen in der M-Phase am Metaphase-Anaphase-Checkpoint (Spindel-Assembly-Checkpoint). Verwendet bei 50–100 ng/mL für 12–18 Stunden. Der mitotische Index kann >90 % erreichen. Mitotische Zellen runden sich ab und lösen sich von der Kultur Oberfläche, sie können durch Abschütteln ohne Trypsinierung geerntet werden, eine Methode namens mitotisches Abschütteln. Die Freisetzung ist schnell (Zellen verlassen die Mitose innerhalb von 30–60 Minuten nach dem Auswaschen), aber die Arretierung ist bei Verlängerung über 18 Stunden toxisch.

Colchicin. Ähnlicher Mechanismus wie Nocodazol, aber toxischer und weniger reversibel. Wird bei 50–100 ng/mL verwendet. Colchicin wird häufiger für zytogenetische Präparationen (Chromosomenspreitung) als für funktionelle Tests verwendet.

Mimosin. Eine pflanzliche Aminosäure, die die Initiation der DNA-Replikation hemmt und Zellen in der späten G1-Phase (nicht an der G1/S-Grenze) arretiert. Verwendet bei 0,5–2 mM für 12–24 Stunden. Mimosin wird weniger häufig verwendet als Thymidin, hat aber den Vorteil, in G1 statt an der G1/S-Grenze zu arretieren, was für die Untersuchung früher G1-Ereignisse nützlich ist.

Serum Entzug

Das Entfernen von Serum aus dem Kulturmedium für 24–72 Stunden treibt Zellen in G0 (Ruhezustand). Nach erneuter Serumzugabe treten die Zellen in G1 wieder in den Zellzyklus ein. Die Methode ist einfach und weit verbreitet für primäre Zellen und Fibroblasten. Die G0/G1-Synchronisationseffizienz variiert je nach Zelltyp, HEK-293-Zellen werden durch Serum Entzug weitgehend unbeeinflusst, während NIH-3T3-Zellen effektiv arretieren.

Serum Entzug verursacht globale Veränderungen im Stoffwechsel, in der Signalübertragung (mTOR, MAPK) und in der Genexpression, die nicht auf den Zellzyklusarrest beschränkt sind. Es sollte nicht für Experimente verwendet werden, bei denen metabolische oder Signal-Grundlinien entscheidend sind.

Physikalische Methoden

Mitotisches Abschütteln. Während des Nocodazol-Blocks oder sogar im logarithmischen Wachstum runden sich mitotische Zellen ab und lösen sich ab. Sanftes Klopfen der Kulturflasche löst sie in das Medium. Die geernteten Zellen sind >95 % mitotisch und können für einen synchronen Fortschritt in G1 neu ausgesät werden. Die Ausbeute ist gering (1–3 % der Population) und die Methode funktioniert nur für adhärente Zellen.

Zentrifugale Elutriation. Zellen werden in einer Gegenstromzentrifuge nach Größe getrennt, große Zellen (G2/M) sedimentieren schneller, kleine Zellen (G1) eluieren zuerst. Die Methode erfordert spezielle Ausrüstung (Beckman JE-5.0 oder ähnlich), liefert aber synchronisierte Populationen ohne chemische Störung. Sie funktioniert sowohl für adhärente als auch für Suspensionszellen und kann 10⁸–10⁹ synchronisierte Zellen pro Lauf produzieren.

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Mit einem vitalen DNA-Farbstoff (Hoechst 33342) gefärbte Zellen werden in G1-, S- und G2/M-Populationen sortiert. Die Methode liefert hochreine Populationen (>99 %), aber der Sortierprozess ist belastend und die Ausbeute gering (10⁶–10⁷ Zellen pro Stunde).

Verifikation

Die Synchronisationseffizienz muss verifiziert werden, typischerweise durch Zellzyklusanalyse mittels Propidiumiodid-DNA-Färbung und Durchflusszytometrie. Der Anteil der Zellen in der Zielphase sollte für eine erfolgreiche Synchronisation >80–90 % betragen. Für die mitotische Synchronisation wird p-H3S10-Färbung verwendet.

Auswahl einer Methode

Chemische Methoden sind am zugänglichsten, können aber Artefakte einführen. Physikalische Methoden vermeiden Chemikalien, erfordern jedoch spezielle Ausrüstung oder ergeben weniger Zellen.