Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist eine optische Bildgebungstechnik, die Auflösung und Kontrast durch Eliminierung von Streulicht verbessert. Eine Lochblende vor dem Detektor blockiert Licht aus Ebenen oberhalb und unterhalb der Fokusebene, sodass nur Licht aus dem Brennpunkt den Detektor erreicht. Diese optische Schnittfähigkeit ermöglicht die Bildgebung dicker Proben und die dreidimensionale Rekonstruktion.
In einem Konfokalmikroskop wird ein Laserstrahl aufgeweitet und durch das Objektiv auf einen beugungsbegrenzten Punkt in der Probe fokussiert. Fluoreszierende Moleküle im Fokusvolumen werden angeregt und emittieren Licht, das vom selben Objektiv gesammelt wird. Ein dichroitischer Spiegel trennt Anregungs- und Emissionspfad, und eine variable Lochblende in der konjugierten Bildebene blockiert Streulicht außerhalb der Fokusebene. Ein Photomultiplier oder eine Lawinenphotodiode detektiert das Signal.
Der Strahl wird mittels Galvanometerspiegeln rasterförmig über die Probe geführt, wodurch das Bild Pixel für Pixel aufgebaut wird. Die Scangeschwindigkeit liegt typischerweise zwischen 0,5 und 4 Bildern pro Sekunde bei 512×512 Pixeln. Resonanzscanner erreichen Video-Raten für Lebendzellanwendungen.
Die laterale Auflösung der konfokalen Mikroskopie beträgt etwa 0,2 µm und die axiale Auflösung etwa 0,5 µm mit hochaperturigen Objektiven. Die Auflösung hängt von der Anregungswellenlänge und der numerischen Apertur des Objektivs ab. Der Lochblendendurchmesser wird auf 0,5–1 Airy-Einheit eingestellt, um Auflösung und Signalintensität auszugleichen.
Mehrkanal-Bildgebung regt nacheinander mehrere Fluorophore mit verschiedenen Laserlinien an und detektiert die Emission durch separate Detektoren oder Spektralkanäle. Häufige Fluorophore sind DAPI, FITC, TRITC, Cy3, Cy5 und Alexa-Farbstoffe. Spektrale Entmischung trennt überlappende Emissionsspektren.
Z-Stapel-Aufnahmen sammeln eine Reihe optischer Schnitte in verschiedenen Fokustiefen. Maximum-Intensitäts-Projektion und Volumen-Rendering rekonstruieren dreidimensionale Strukturen. Zeitraffer-Bildgebung erfasst dynamische Prozesse in lebenden Proben. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) misst molekulare Mobilität. Photoaktivierung und Photokonversion verfolgen spezifische Subpopulationen.
Die Anwendungen umfassen Zellbiologie, Neurobiologie, Entwicklungsbiologie und Materialwissenschaften. CLSM bildet das Zytoskelett, intrazelluläre Signalwege, Membrandynamik und subzelluläre Lokalisation in fixierten und lebenden Zellen ab. In den Materialwissenschaften charakterisiert CLSM Oberflächentopographie, Beschichtungsdicke und Partikelverteilung.
