Überblick

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Strukturanalyse umfasst die computergestützten Arbeitsabläufe, die dreidimensionale makromolekulare Strukturen aus Zehntausenden von zweidimensionalen Projektionsbildern rekonstruieren, die mit einem Elektronenmikroskop aufgenommen wurden. In der Einzelpartikel-Kryo-EM werden gereinigte Makromoleküle, die in verglastem Eis eingebettet sind, in zufälligen Orientierungen abgebildet, und hochentwickelte Algorithmen bestimmen die Orientierungen, klassifizieren Konformationszustände und rekonstruieren eine dreidimensionale Dichtekarte mit nahezu atomarer Auflösung. Die Auflösungsrevolution des letzten Jahrzehnts hat Kryo-EM zur Methode der Wahl für viele große und flexible makromolekulare Komplexe gemacht.

Methoden

Die Computer-Pipeline beginnt mit der Bewegungskorrektur und der Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF), um strahlinduzierte Bewegung und optische Aberrationen zu korrigieren. Das Partikel-Picking: zunehmend von Deep-Learning-basierten Werkzeugen wie Topaz und crYOLO durchgeführt, identifiziert einzelne Partikelbilder. Die 2D-Klassifikation gruppiert Partikel in homogene Klassen, und die 3D-Klassifikation trennt verschiedene Konformationszustände. Die 3D-Rekonstruktion mittels Fourier-basierter Methoden (RELION, cryoSPARC) verfeinert iterativ die Orientierungsparameter und erstellt die Dichtekarte. Die endgültige Auflösung wird anhand des Fourier-Shell-Korrelationskriteriums (FSC) bewertet.

Anwendungen

Kryo-EM hat Strukturen des Ribosoms, Spleißosoms, von Membranproteinen und Viruskapsiden gelöst, die aufgrund ihrer Größe oder Flexibilität für die Röntgenkristallographie unzugänglich waren. Die resultierenden Dichtekarten ermöglichen den Aufbau atomarer Modelle, die anhand bekannter Proteinstruktur-Prinzipien validiert werden. Kryo-EM offenbart die Architektur großer Zellstrukturen und Organellen, einschließlich des Kernporenkomplexes und mitochondrialer respiratorischer Superkomplexe. Die Technik stützt sich auf Mikroskopietechniken für das Probenscreening und ist zu einem integralen Bestandteil der Strukturbiologie geworden, wobei die computergestützte Analyse ihre zentrale Schlüsseltechnologie darstellt.