Kryokonservierung ist der Prozess der Konservierung lebender Zellen, Gewebe oder Mikroorganismen bei extrem niedrigen Temperaturen (typischerweise −80 °C oder −196 °C in flüssigem Stickstoff), sodass sie für die zukünftige Verwendung lebensfähig bleiben. Ein gut verwaltetes Zellbank gewährleistet experimentelle Reproduzierbarkeit über Jahre.

Prinzipien

Die Bildung von Eiskristallen ist die Hauptursache für den Zelltod während des Einfrierens. Intrazelluläres Eis durchsticht Membranen und stört Organellen. Kryoprotektiva (CPAs) schützen Zellen durch:

• Eindringen in die Zelle (z. B. DMSO, Glycerol), um Wasser zu verdrängen und den Gefrierpunkt zu senken.
• Nicht eindringende (z. B. Saccharose, Ficoll) entwässern Zellen vor dem Einfrieren.

Die Kühlrate muss zwei konkurrierende Effekte ausbalancieren: zu langsam verursacht osmotischen Schaden durch längere Exposition gegenüber konzentrierten Lösungen; zu schnell verursacht tödliches intrazelluläres Eis. Die meisten Säugetierzellen werden optimal mit −1 °C pro Minute gekühlt.

Kryoprotektiva

• DMSO (Dimethylsulfoxid): das am weitesten verbreitete CPA. Typische Konzentration ist 5–10 % (v/v) in Kulturmedium mit 10–20 % FBS oder serumfreiem Einfriermedium. DMSO ist bei Raumtemperatur über Zeit toxisch für Zellen — arbeiten Sie schnell und halten Sie Zellen auf Eis.
• Glycerol: 10–20 % (v/v). Weniger toxisch als DMSO, aber weniger penetrierend. Häufig verwendet für Bakterien, Hefen und einige Zelllinien.
• Serumfreie Einfriermedien: kommerzielle Formulierungen (z. B. CryoStor, Recovery Cell Culture Freezing Medium) verwenden definierte CPAs ohne tierisches Serum.

Einfrierprotokoll

1. Ernten Sie Zellen in der Log-Phase bei >90 % Viabilität.
2. Zählen und zentrifugieren Sie bei 200–300 × g für 5 Minuten.
3. Resuspendieren Sie in kaltem Einfriermedium bei 1–5 × 10⁶ Zellen/mL.
4. Verteilen Sie in Kryoröhrchen (1 mL pro Röhrchen). Beschriften Sie mit Zelllinie, Passagenzahl, Datum und Bearbeiter.
5. Kühlen Sie mit −1 °C/min unter Verwendung eines geregelten Kühlgeräts, eines Isopropanol-Einfrierbehälters (Mr. Frosty) oder einer passiven Kühlvorrichtung.
6. Transferieren Sie für 24 Stunden zu −80 °C (Kurzzeitlagerung), dann in flüssigen Stickstoff (−196 °C) für die Langzeitlagerung.

Auftauprotokoll

1. Entfernen Sie das Röhrchen aus der Lagerung und legen Sie es sofort in ein 37 °C warmes Wasserbad mit sanfter Bewegung.
2. Tauen Sie, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist (etwa 1–2 Minuten).
3. Wischen Sie das Röhrchen mit 70% Ethanol ab.
4. Transferieren Sie den Inhalt tropfenweise in 10 mL vorgewärmtes Kulturmedium.
5. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 Minuten, um DMSO zu entfernen, resuspendieren Sie in frischem Medium und plattieren Sie.

Bakterien- und Hefekryokonservierung

Bakterien und Hefen sind einfacher zu konservieren. Mischen Sie eine Übernachtkultur 1:1 mit sterilem 50% Glycerol in einem Kryoröhrchen, vortexen Sie und frieren Sie bei −80 °C ein. Zur Rückgewinnung kratzen Sie die Oberfläche des gefrorenen Bestands mit einer sterilen Öse ab und streichen Sie auf eine Agarplatte — tauen Sie nicht den gesamten Bestand auf.

Gute Zellbankpraxis

• Erstellen Sie eine Master Cell Bank (MCB) bei der niedrigsten möglichen Passagenzahl, leiten Sie dann Working Cell Banks (WCBs) von der MCB ab.
• Testen Sie MCBs auf Mykoplasmen, bakterielle Kontamination und Identität (STR-Profilierung für humane Zelllinien).
• Lagern Sie MCB-Röhrchen an zwei physisch getrennten Orten.
• Überwachen Sie den Flüssigstickstoffspiegel und führen Sie ein Temperaturprotokoll.