Gereinigte Proteine befinden sich selten genau in dem Puffer, der für den nächsten Schritt erforderlich ist — sei es für Kristallisation, Aktivitätstests oder Formulierung. Dialyse, Ultrafiltration und Entsalzungssäulen sind die Standardwerkzeuge für den Pufferaustausch.
Dialyse
Die Dialyse verwendet eine semipermeable Membran mit einer definierten Molekulargewichtsausschlussgrenze (MWCO), um kleine Moleküle von größeren zu trennen. Die Proteinprobe wird in den Dialyseschlauch eingeschlossen und in ein großes Volumen des gewünschten Puffers gegeben. Kleine Moleküle (Salze, Reduktionsmittel, Denaturierungsmittel) diffundieren durch die Membran in das Dialysat, bis ein Gleichgewicht erreicht ist.
MWCO-Auswahl: wählen Sie eine Membran mit einer Porengröße, die weniger als die Hälfte des Molekulargewichts des Proteins beträgt, um einen vollständigen Rückhalt zu gewährleisten. Standard-MWCO-Werte sind 3,5, 6–8, 10 und 14 kDa. Für die meisten Proteine ist eine MWCO von 6–8 kDa oder 10 kDa geeignet.
Protokoll:
- Befeuchten Sie die Dialysemembran 30 Minuten lang in destilliertem Wasser oder Puffer.
- Spülen Sie mit dem Dialysepuffer.
- Füllen Sie die Probe in den Schlauch und lassen Sie Luftraum für Volumenänderungen.
- Verschließen Sie mit Klammern und legen Sie in 100–200 Volumen Puffer.
- Rühren Sie sanft bei 4 °C. Wechseln Sie den Puffer 2-3 Mal über 12–24 Stunden.
- Entnehmen Sie die Probe — sie kann sich durch osmotische Effekte leicht verdünnt haben.
Slide-A-Lyzer-Kassetten (Thermo) verwenden einen starren Kunststoffrahmen mit einer integrierten Membran, wodurch die Handhabung des Schlauchs entfällt. Sie schwimmen auf dem Puffer und sind für kleine Volumen leichter zu handhaben.
Ultrafiltration (Zentrifugalkonzentratoren)
Zentrifugalkonzentratoren (Amicon Ultra, Vivaspin) kombinieren Filtration mit Zentrifugation. Eine Membran am Boden eines Probenreservoirs lässt Wasser und kleine gelöste Stoffe passieren, während das Protein über der Membran zurückgehalten wird. Zentrifugation bei 3000–5000 × g treibt die Flüssigkeit durch die Membran.
Konzentration: das Probenvolumen wird durch Verwerfen des Filtrats reduziert. Führen Sie kurze Zentrifugationsschritte (5–10 Minuten) durch, um Überkonzentration zu vermeiden, die Ausfällung verursachen kann. Überwachen Sie das Retentatvolumen anhand der Markierungen auf dem Gerät.
Pufferaustausch durch Diafiltration: anstatt bis zur Trockene zu konzentrieren, geben Sie den neuen Puffer zum Retentat und zentrifugieren erneut. Wiederholen Sie 3–5 Mal; jeder Zyklus tauscht etwa 90 % des Puffers aus. Fünf Zyklen erreichen >99,99 % Austausch.
MWCO-Auswahl: wie bei der Dialyse wählen Sie eine MWCO, die mindestens 2× kleiner ist als das Protein. Im Gegensatz zur Dialyse basiert die MWCO-Bewertung für Konzentratoren auf dem Rückhalt globulärer Proteine — lineare Polymere und einige Detergenzien können eine nominell rückhaltende Membran passieren.
Entsalzungssäulen (Größenausschluss)
Entsalzungssäulen (PD-10, Zeba Spin, NAP-5) verwenden Größenausschlusschromatographie (SEC) mit Säulen aus kleinen Kügelchen. Die Probe wird auf die Säule gegeben, und große Moleküle (Proteine) eluieren im Ausschlussvolumen vor kleinen Molekülen (Salzen, Nukleotiden, Reduktionsmitteln). Das Protein wird im neuen Puffer ohne Verdünnung (PD-10) oder mit minimaler Verdünnung (Zeba) gesammelt.
Die Entsalzung ist schneller als die Dialyse (5–15 Minuten vs. Stunden), ist aber auf Probenvolumen beschränkt, die für die Säulengröße geeignet sind (typischerweise 0,5–2,5 mL). Für größere Volumen wird Dialyse oder Tangentialflussfiltration verwendet.
