Übersicht
Epigenomics ist die genomweite Untersuchung epigenetischer Modifikationen – chemische Veränderungen an DNA und Chromatin, die die Genexpression regulieren, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern. Zu diesen Modifikationen gehören DNA-Methylierung an CpG-Dinukleotiden, posttranslationale Histonmodifikationen (wie Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung) und Zugänglichkeitsmuster für Chromatin. Epigenomkarten variieren je nach Zelltyp, Entwicklungsstadium und Krankheitsstadium und bieten eine dynamische Informationsebene, die das statische Genom ergänzt. Großprojekte wie die Konsortien ENCODE und Roadmap Epigenomics haben umfassende epigenomische Atlanten für Hunderte menschlicher Zelltypen erstellt.
Methoden
Die epigenomische Profilerstellung basiert auf Techniken, die für die Hochdurchsatzsequenzierung geeignet sind. Whole-Genome Bisulfit Sequencing (WGBS) wandelt unmethylierte Cytosine in Uracil um und ermöglicht so Methylierungskarten mit Einzelbasenauflösung. ChIP-seq verwendet Antikörper zur Immunpräzipitation spezifischer Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktor-gebundener Regionen, gefolgt von der Sequenzierung. ATAC-seq und DNase-seq kartieren offene Chromatinregionen, um aktive regulatorische Elemente zu identifizieren. Hi-C und verwandte Methoden erfassen die dreidimensionale Chromatinkonformation. Bioinformatik-Pipelines verarbeiten Rohdaten durch Ausrichtung, Peak-Calling (mit MACS2 oder PeakDene) und differenzielle Anreicherungsanalyse. Eine integrative Analyse, die mehrere epigenomische Spuren kombiniert, deckt Chromatinzustände – wie aktive Promotoren, Enhancer und unterdrückte Regionen – mithilfe von Tools wie ChromHMM auf.
Anwendungen
Die Epigenomik hat unser Verständnis von Entwicklung, Alter und Krankheit verändert. Abweichende DNA-Methylierungsmuster sind Kennzeichen von Krebs, wobei die Stummschaltung von Tumorsuppressorgenen durch Promotor-Hypermethylierung mittlerweile ein therapeutisches Ziel ist. Die epigenomische Profilierung leitet die Entdeckung von Enhancern und anderen regulatorischen Elementen, die in [Genregulierung und Epigenetik] (/guides/gene-regulation-and-epigenetics.html) untersucht werden. Die Technik ist eng mit der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) verwandt, ist jedoch auf das gesamte Genom skaliert. Epigenomics beleuchtet auch, wie der Zeitpunkt der DNA-Replikation mit dem Chromatinzustand korreliert und wie Umwelteinflüsse bleibende epigenetische Spuren hinterlassen, die die Gesundheitsergebnisse über die gesamte Lebensspanne hinweg beeinflussen.
Praktisches Protokoll
Beginnen Sie für die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) mit 100–500 ng genomischer DNA, versetzt mit 0,5 % unmethylierter Lambda-Phagen-DNA als Konvertierungskontrolle. Fragmentieren Sie die DNA durch Ultraschallbehandlung auf 200–400 bp und führen Sie dann die Endreparatur, das A-Tailing und die Adapterligation durch. Behandeln Sie es mit Natriumbisulfit mit dem EZ DNA Methylation-Gold Kit, das unmethylierte Cytosine in Uracil umwandelt, während methylierte Cytosine intakt bleiben. PCR-Amplifikation (12 Zyklen) mit Uracil-toleranter Polymerase (z. B. PfuTurbo Cx) und Sequenz Paired-End 150 bp. Lesevorgänge mit „Bismark“ ausrichten: „bismark –genome genome_dir -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o bismark_output“. Entfernen Sie doppelte Lesevorgänge mit „deduplicate_bismark“. Methylierungsaufrufe extrahieren: „bismark_methylation_extractor –gzip –bedGraph –counts –buffer_size 10G bismark_output.bam“. Die Ausgabe umfasst Methylierungsprozentsätze pro CpG in einer bedGraph- oder CX-Berichtsdatei. Für die differenzielle Methylierungsanalyse verwenden Sie „methylKit“ in R: „methRead“, um Coverage-Dateien zu importieren, „calculateDiffMeth“, um differenziell methylierte Cytosine oder Regionen mit einem q-Wert < 0,05 und einem Methylierungsunterschied > 25 % zu identifizieren. Für die ENCODE ChIP-seq-Histonmodifikationsanalyse verarbeiten Sie Rohlesevorgänge über die ENCODE-Pipeline: Richten Sie sie mit „Bowtie2“ aus, filtern Sie Duplikate, rufen Sie Spitzen mit „MACS2“ im „–broad“-Modus für H3K27me3 oder H3K36me3 auf und generieren Sie Signalspuren mit „bedClip“ und „bedGraphToBigWig“. Die Chromatin-Zustandssegmentierung mit ChromHMM kombiniert mehrere Histonmarkierungen (H3K4me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K36me3, H3K27me3) in einem kombinatorischen Modell: „java -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 200 binarized_beds output_dir 15 hg38“. Das 15-Zustands-Modell segmentiert das Genom in aktive Promotoren, Enhancer, transkribierte Regionen, unterdrückte Polycomb-Domänen und Heterochromatin.
