Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verwendet fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, um spezifische DNA-Sequenzen auf Metaphasechromosomen und in Interphasekernen nachzuweisen und zu lokalisieren, was eine direkte Visualisierung der genomischen Organisation und von Anomalien ermöglicht.
Prinzip
FISH folgt denselben Hybridisierungsprinzipien wie die kolorimetrische In-situ-Hybridisierung, verwendet jedoch Fluorophor-konjugierte Sonden zur direkten Detektion ohne enzymatische Amplifikation. Die Fluoreszenzsignale werden durch Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie sichtbar gemacht. Mehrere Sonden mit unterschiedlichen Fluorophoren können gleichzeitig angewendet werden, was eine Mehrfarbenanalyse mehrerer genomischer Loci in einer einzigen Probe ermöglicht.
Sondentypen
Lokusspezifische Sonden zielen auf einzigartige genomische Regionen ab, typischerweise 50–500 kb, die in BACs oder Fosmiden kloniert sind. Sie werden durch Nick-Translation mit fluoreszierenden Nukleotiden wie SpectrumOrange, SpectrumGreen oder Cy5 markiert. Zentromersonden zielen auf Alpha-Satelliten-Wiederholungssequenzen ab und identifizieren spezifische Chromosomen. Telomersonden markieren Chromosomenenden. Ganzchromosomen-Farbsonden sind komplexe Mischungen von Sequenzen, die für ein einzelnes Chromosom einzigartig sind und durch Durchflusszytometrie oder Mikrodissektion gewonnen werden. Oligonukleotid-basierte Sondensätze, die auf Microarrays synthetisiert werden, bieten jetzt anpassbare, hochauflösende Abdeckung.
Markierungsmethoden
Die direkte Markierung inkorporiert Fluorophor-konjugierte Nukleotide während der Sondenherstellung. Die Detektion erfolgt unmittelbar nach der Hybridisierung. Die indirekte Markierung inkorporiert Haptene wie Digoxigenin oder Biotin, die nach der Hybridisierung mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern oder Streptavidin nachgewiesen werden. Indirekte Methoden bieten eine Signalverstärkung durch Antikörperschichten und sind nützlich für kleine Zielsequenzen. Die Tyramidsignalverstärkung erhöht die Empfindlichkeit weiter.
Probenvorbereitung
Metaphase-Chromosomenpräparate werden aus Colcemid-arretierten Zellkulturen hergestellt, hypotonisch aufgequollen und in Methanol:Eisessig (3:1) fixiert. Interphasekerne werden aus unkultivierten Zellen oder fixierten Geweben gewonnen. Die Proben werden gealtert, mit RNase und Pepsin behandelt, um den Hintergrund zu reduzieren, und durch eine Ethanolreihe dehydriert. Die Denaturierung der Ziel-DNA in 70%igem Formamid bei 72 °C ist für doppelsträngige Sonden erforderlich. Formamidfreie Protokolle, die Hitzdenaturierung im Hybridisierungspuffer verwenden, sind Alternativen.
Hybridisierung und Waschen
Sonde und Ziel werden bei 75 °C für 5 Minuten co-denaturiert und dann bei 37 °C für 4–16 Stunden in einer befeuchteten Kammer hybridisiert. Nach der Hybridisierung entfernen Waschschritte in SSC und Tween-20 ungebundene Sonde. Die Stringenz wird durch Formamidkonzentration, Waschtemperatur und Salzkonzentration gesteuert. Nach den Waschschritten werden die Objektträger mit DAPI gegengefärbt, was ein Q-Bandenmuster auf Metaphasechromosomen zur Karyotypidentifizierung erzeugt.
Mehrfarben-FISH
Multiplex-FISH (M-FISH) verwendet Kombinationen von fünf Fluorophoren in einem kombinatorischen Markierungsschema, um 24 chromosomenspezifische Sondensätze zu erzeugen, jeder mit einer eindeutigen spektralen Signatur. Das spektrale Karyotyping verwendet einen ähnlichen Ansatz mit bildgebender Spektrometrie. Diese Techniken ermöglichen eine umfassende Karyotypanalyse in einem einzigen Experiment und detektieren komplexe Umlagerungen, Markerchromosomen und kryptische Translokationen.
Anwendungen
FISH ist ein klinischer Standard für den Nachweis chromosomaler Aneuploidien in der Pränataldiagnostik unter Verwendung unkultivierter Amniozyten und Chorionzottenproben. Der HER2-Genamplifikationsstatus bei Brustkrebs wird routinemäßig durch FISH bewertet. Der BCR-ABL-Fusionsnachweis bei chronischer myeloischer Leukämie verwendet Zweifarben-Doppelfusionssonden an Interphasekernen. Das Philadelphia-Chromosom t(9;22) erscheint als Fusionssignal. FISH an formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten kartiert genomische Veränderungen in soliden Tumoren. Chromosomenspezifische Farben sind in der Strahlenbiologie für die Quantifizierung von DNA-Schäden und -Reparatur durch Mikrokern- und Translokationsassays unerlässlich.
