Übersicht
Ziel der funktionellen Genomik ist es, die Lücke zwischen Genomsequenz und biologischer Funktion zu schließen, indem die Rollen von Genen, ihren Produkten und ihre Interaktionen auf genomweiter Ebene systematisch charakterisiert werden. Während die strukturelle Genomik den statischen Bauplan der DNA eines Organismus liefert, fragt die funktionelle Genomik, was jedes Element tut, wann und wo es aktiv ist und wie es an zellulären Netzwerken teilnimmt. Das Feld integriert Daten aus Transkriptomik, Proteomik und Hochdurchsatz-Störungsscreenings, um jedem Gen eine biologische Funktion zuzuordnen. Diese Perspektive auf Systemebene ist für das Verständnis komplexer Phänotypen unerlässlich geworden.
Methoden
Mehrere Hochdurchsatzansätze unterstützen die funktionelle Genomik. Funktionsverlust-Screenings nutzen RNA-Interferenz (RNAi) oder CRISPR-Cas9 Bibliotheken, um Gene systematisch auszuschalten und phänotypische Konsequenzen zu beobachten. Gain-of-Function-Screens überexprimieren cDNA-Bibliotheken, um Gene zu identifizieren, die bestimmte Phänotypen steuern. Protein-Interaktionskartierung (über Hefe-Zwei-Hybrid- oder Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie) baut genomweite Interaktionsnetzwerke auf. Genexpressionsprofilierung mithilfe von RNA-seq oder Microarrays deckt Koexpressionsmuster auf, die auf funktionelle Beziehungen schließen lassen. Die Integration verschiedener Datentypen durch maschinelles Lernen sagt die Genfunktion mit zunehmender Genauigkeit voraus und weist Annotationen wie Gen-Ontologie-Begriffe basierend auf Multi-Omics-Beweisen zu.
Anwendungen
Funktionelle Genomik treibt Entdeckungen in allen Lebensbereichen voran. In der Krebsforschung identifizieren CRISPR-Screenings Gene, die für das Tumorwachstum essentiell sind, und Gene, deren Verlust [Arzneimittelresistenz] verleiht (/guides/gene-regulation-and-epigenetics.html). In der Mikrobiologie lokalisieren genomweite Fitnesstests die Gene, die für die Pathogenese erforderlich sind. Zu den landwirtschaftlichen Anwendungen gehört die Identifizierung von Genen, die Ertrag, Stresstoleranz und Nährstoffgehalt steuern, durch kombinierte [rekombinante DNA-Technologie] (/guides/recombinant-dna-technology.html) und funktionelles Screening. Das Gebiet entwickelt sich mit Einzelzelltechnologien und in vivo CRISPR-Screenings weiter, die die Genfunktion in nativen Gewebekontexten aufdecken und uns einer vollständigen funktionellen Annotation des Genoms näher bringen.
Praktisches Protokoll
Für ein ChIP-seq-Experiment zur Identifizierung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren beginnen Sie mit der Vernetzung der Zellen mit 1 % Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und löschen Sie sie dann mit Glycin ab. Chromatin wird durch Ultraschallbehandlung (z. B. Covaris oder Diagenode Bioruptor) in 200–600 bp große Fragmente zerschnitten. Bei der Immunpräzipitation werden 2–5 µg zielspezifischer Antikörper über Nacht bei 4 °C an Protein A/G-Magnetkügelchen gekoppelt. Nach dem Waschen 6 Stunden lang bei 65 °C mit Proteinase K rückvernetzen und anschließend die DNA durch Säulenreinigung reinigen. Bibliotheken werden mit Endreparatur, A-Tailing, Adapterligatur und 12–15 PCR-Zyklen vorbereitet. Sequenz auf Illumina mit Single-End-50-bp-Reads. Führen Sie die ENCODE ATAC-seq-Pipeline für die offene Chromatin-Profilierung an gefrorenen oder frischen Zellen aus: Kerne werden durch Inkubation mit Lysepuffer isoliert und dann 30 Minuten lang bei 37 °C mit Tn5-Transposase markiert: „tagment –input 50000 Zellen –output tagmented.bam“. PCR-Amplifikation mit Barcode-Primern für 8–12 Zyklen und Sequenzierung am gepaarten Ende. Richten Sie zur Datenanalyse Lesevorgänge mit „Bowtie2“ aus, indem Sie „–very-sensitive“ für ATAC-seq oder „BWA“ für ChIP-seq verwenden. Entfernen Sie Duplikate mit „Picard MarkDuplicates“. Peak-Aufruf mit „MACS2“: „macs2 callpeak -t ausgerichtet.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n sample -q 0.05“. Für Histonmarkierungen wie H3K4me3 verwenden Sie den Broad-Peak-Modus mit „–broad“. Zu den Qualitätsmetriken gehören der Anteil der Lesevorgänge in Peaks (FRiP > 1 % für Transkriptionsfaktoren, > 10 % für Histonmarkierungen), NSC (normalisierter Strangkoeffizient > 1,05) und RSC (relative Strangkorrelation > 0,8). Die differenzielle Bindungsanalyse zwischen Bedingungen verwendet „DiffBind“ in R und die Motivanreicherung wird mit „HOMER“ oder „MEME-ChIP“ getestet.
