Gateway-Klonierung

Die Gateway-Klonierung nutzt das ortsspezifische Rekombinationssystem des Bakteriophagen Lambda. Sie macht Restriktionsenzyme und DNA-Ligase überflüssig, indem sie Rekombinationssequenzen verwendet, die von spezifischen Enzymen erkannt werden.

Das System arbeitet in zwei Reaktionen:

• BP-Reaktion: Ein PCR-Produkt mit flankierenden attB-Stellen rekombiniert mit einem Donorvektor (pDONR), der attP-Stellen enthält. Der BP-Clonase-Enzymmix katalysiert die Reaktion und erzeugt einen Entry-Klon mit dem Insert, das von attL-Stellen flankiert wird.
• LR-Reaktion: Der Entry-Klon rekombiniert mit einem Destination-Vektor, der attR-Stellen enthält. Die LR-Clonase überträgt das Insert in den Destination-Vektor, der die entsprechenden Expressionselemente (Promotor, Tag, Selektionsmarker) für den Zielorganismus bereitstellt.

Die Gateway-Klonierung ist gerichtet, erhält den Leserahmen und ermöglicht es, denselben Entry-Klon in Dutzende von Destination-Vektoren zu schleusen (z. B. für Expression in Bakterien, Säugetierzellen, Hefen oder Pflanzen). Die Haupteinschränkung ist die Größe der Rekombinationsstellen (attB1 und attB2 sind ~50 bp), die dem exprimierten Protein zusätzliche Aminosäuren hinzufügen, es sei denn, sie werden durch einen Proteaseverdau entfernt.

TOPO-Klonierung

Die TOPO-Klonierung verwendet Topoisomerase I aus dem Vaccinia-Virus, die DNA schneidet und kovalent an das 3′-Phosphat gebunden bleibt. Ein linearisierter TOPO-Vektor hat an beiden Enden Topoisomerase. Wenn ein PCR-Produkt mit kompatiblen Enden hinzugefügt wird, religiert die Topoisomerase den Vektor und fügt das PCR-Produkt ein — keine Ligase erforderlich.

TOPO-TA-Klonierung: Die Taq-Polymerase fügt PCR-Produkten einen einzelnen 3′-A-Überhang hinzu. Der TOPO-Vektor hat komplementäre 3′-T-Überhänge. Das PCR-Produkt wird 5 Minuten bei Raumtemperatur mit dem linearisierten Vektor gemischt und dann in kompetente Zellen transformiert. Dies ist die einfachste verfügbare Klonierungsmethode, da keine Restriktionsverdauung, Ligation oder Aufreinigung nach der PCR erforderlich ist.

TOPO-Blunt-End-Klonierung: PCR-Produkte mit stumpfen Enden (von proofreading-Polymerasen) werden mit einer für die Blunt-End-Ligation optimierten Version des TOPO-Vektors kloniert. Die Effizienz ist mit der TA-Klonierung mit dem richtigen Vektor vergleichbar.

Auswahl zwischen den Methoden

Die TOPO-Klonierung ist schneller (5 Minuten bei Raumtemperatur) und besser geeignet für die schnelle Subklonierung eines einzelnen Inserts. Gateway erfordert mehr Vorbereitung (attB-Adapter auf PCR-Primern, separate Entry- und Destination-Vektoren), skaliert aber auf Hochdurchsatz-Anwendungen und macht den Wechsel zwischen Expressionssystemen trivial.