Mit zunehmender Komplexität synthetisch-biologischer Konstrukte wird die traditionelle Restriktionsklonierung unpraktisch. Gibson-Assembly und Golden-Gate-Klonierung ermöglichen die Multi-Fragment-Montage in einer einzigen Eintopf-Reaktion.
Gibson-Assembly
Die Gibson-Assembly verbindet mehrere DNA-Fragmente mit überlappenden Enden in einer einzigen isothermen Reaktion bei 50 °C. Der Reaktionsmix enthält drei enzymatische Aktivitäten:
- 5′-Exonuklease (T5-Exonuklease oder RecE): verdaut die 5′-Enden der doppelsträngigen DNA und hinterlässt einzelsträngige 3′-Überhänge, die die Anlagerung komplementärer Fragmente ermöglichen.
- DNA-Polymerase (Phusion oder Taq): füllt die nach der Anlagerung verbleibenden Lücken auf.
- DNA-Ligase (Taq-Ligase): verschließt die Nickstellen in der assemblierten DNA.
Jedes Fragment muss 15–40 bp Homologie zu seinem Nachbarn an der Verbindungsstelle aufweisen. Diese Überlappungen werden durch PCR-Primer hinzugefügt. Die Gibson-Assembly kann 2–15 Fragmente gleichzeitig verbinden. Die Montage ist narbenfrei — es verbleiben keine Restriktionsstellen im Endprodukt.
Die Reaktion erfordert 50–100 ng jedes Fragments in äquimolaren Mengen und ist in 15–60 Minuten bei 50 °C abgeschlossen. Das Produkt wird direkt in chemisch kompetente E. coli transformiert. Die Gibson-Assembly ist ideal für:
- Die Assemblierung synthetischer Gene aus Oligonukleotiden.
- Den Bau kompletter Plasmide aus überlappenden Fragmenten.
- Die Konstruktion von Genom-Engineering-Kassetten mit Homologiearmen.
- Die Erstellung von DNA-Bibliotheken für die gerichtete Evolution.
Golden-Gate-Klonierung
Die Golden-Gate-Klonierung verwendet Typ-IIS-Restriktionsenzyme (BsaI, BpiI, Esp3I), die außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneiden und dabei definierte 4 bp einzelsträngige Überhänge erzeugen. Diese Überhänge können vom Benutzer festgelegt werden.
Die Reaktion ist ein gleichzeitiger Verdau-Ligationsansatz: Das Typ-IIS-Enzym und die T4-DNA-Ligase werden zusammen in einem Röhrchen gegeben, und das Reaktionsgemisch wird zwischen der optimalen Temperatur des Enzyms (37 °C für BsaI) und 16 °C oder 37 °C (für die Ligation) zyklisiert. Da die Erkennungsstellen aus dem endgültigen assemblierten Produkt entfernt werden, wird die Reaktion vollständig getrieben — das assemblierte Produkt kann nicht erneut verdaut werden.
Golden-Gate ist die Grundlage modularer Klonierungsstandards wie MoClo, Golden Braid und des Plant Toolbox. Es ist ideal für:
- Die kombinatorische Montage genetischer Teile (Promotoren, 5′-UTRs, CDS, Terminatoren, Tags).
- Den Bau von TALEN-Arrays aus einzelnen Repeat-Modulen.
- Die Konstruktion gepoolter sgRNA-Bibliotheken für CRISPR-Screens.
Die Überhänge werden so gestaltet, dass sie in einer definierten Reihenfolge miteinander kompatibel sind, sodass derselbe Vektor verschiedene Kombinationen von Teilen aufnehmen kann. Golden-Gate ist für modulare kombinatorische Projekte skalierbarer als die Gibson-Assembly, erfordert jedoch, dass die Fragmente keine internen Erkennungsstellen für das verwendete Enzym enthalten.
