Mit zunehmender Komplexität synthetisch-biologischer Konstrukte wird die traditionelle Restriktionsklonierung unpraktisch. Gibson-Assembly und Golden-Gate-Klonierung ermöglichen die Multi-Fragment-Montage in einer einzigen Eintopf-Reaktion.
Gibson-Assembly
Die Gibson-Assembly verbindet mehrere DNA-Fragmente mit überlappenden Enden in einer einzigen isothermen Reaktion bei 50 °C. Der Reaktionsmix enthält drei enzymatische Aktivitäten:
- 5′-Exonuklease (T5-Exonuklease oder RecE): verdaut die 5′-Enden der doppelsträngigen DNA und hinterlässt einzelsträngige 3′-Überhänge, die die Anlagerung komplementärer Fragmente ermöglichen.
- DNA-Polymerase (Phusion oder Taq): füllt die nach der Anlagerung verbleibenden Lücken auf.
- DNA-Ligase (Taq-Ligase): verschließt die Nickstellen in der assemblierten DNA.
Jedes Fragment muss 15–40 bp Homologie zu seinem Nachbarn an der Verbindungsstelle aufweisen. Diese Überlappungen werden durch PCR-Primer hinzugefügt. Die Gibson-Assembly kann 2–15 Fragmente gleichzeitig verbinden. Die Montage ist narbenfrei, es verbleiben keine Restriktionsstellen im Endprodukt.
Die Reaktion erfordert 50–100 ng jedes Fragments in äquimolaren Mengen und ist in 15–60 Minuten bei 50 °C abgeschlossen. Das Produkt wird direkt in chemisch kompetente E. coli transformiert. Die Gibson-Assembly ist ideal für:
- Die Assemblierung synthetischer Gene aus Oligonukleotiden.
- Den Bau kompletter Plasmide aus überlappenden Fragmenten.
- Die Konstruktion von Genom-Engineering-Kassetten mit Homologiearmen.
- Die Erstellung von DNA-Bibliotheken für die gerichtete Evolution.
Golden-Gate-Klonierung
Die Golden-Gate-Klonierung verwendet Typ-IIS-Restriktionsenzyme (BsaI, BpiI, Esp3I), die außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneiden und dabei definierte 4 bp einzelsträngige Überhänge erzeugen. Diese Überhänge können vom Benutzer festgelegt werden.
Die Reaktion ist ein gleichzeitiger Verdau-Ligationsansatz: Das Typ-IIS-Enzym und die T4-DNA-Ligase werden zusammen in einem Röhrchen gegeben, und das Reaktionsgemisch wird zwischen der optimalen Temperatur des Enzyms (37 °C für BsaI) und 16 °C oder 37 °C (für die Ligation) zyklisiert. Da die Erkennungsstellen aus dem endgültigen assemblierten Produkt entfernt werden, wird die Reaktion vollständig getrieben, das assemblierte Produkt kann nicht erneut verdaut werden.
Golden-Gate ist die Grundlage modularer Klonierungsstandards wie MoClo, Golden Braid und des Plant Toolbox. Es ist ideal für:
- Die kombinatorische Montage genetischer Teile (Promotoren, 5′-UTRs, CDS, Terminatoren, Tags).
- Den Bau von TALEN-Arrays aus einzelnen Repeat-Modulen.
- Die Konstruktion gepoolter sgRNA-Bibliotheken für CRISPR-Screens.
Die Überhänge werden so gestaltet, dass sie in einer definierten Reihenfolge miteinander kompatibel sind, sodass derselbe Vektor verschiedene Kombinationen von Teilen aufnehmen kann. Golden-Gate ist für modulare kombinatorische Projekte skalierbarer als die Gibson-Assembly, erfordert jedoch, dass die Fragmente keine internen Erkennungsstellen für das verwendete Enzym enthalten.
