Die hydrophobe Interaktionschromatographie trennt Proteine basierend auf Unterschieden in der Oberflächenhydrophobie. Proteine werden unter Hochsalzbedingungen geladen, die hydrophobe Wechselwirkungen mit der stationären Phase fördern, und durch Verringerung der Salzkonzentration eluiert, was den hydrophoben Effekt abschwächt.
Prinzip
Bei hohen Salzkonzentrationen werden Wassermoleküle um die Salzionen herum geordnet (Aussalzeffekt), was die Verfügbarkeit von Wasser zur Solvatisierung hydrophober Stellen auf Proteinoberflächen verringert. Dies zwingt hydrophobe Regionen auf Proteinen, mit hydrophoben Liganden zu interagieren, die auf dem Chromatographiemedium immobilisiert sind. Wenn die Salzkonzentration während der Elution verringert wird, wird Wasser verfügbarer, hydrophobe Wechselwirkungen werden schwächer, und Proteine eluieren in der Reihenfolge zunehmender Oberflächenhydrophobie. Die Bindung hängt von der Art und Konzentration des Salzes ab, wobei Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und NaCl gängige Optionen sind, die in der Hofmeister-Reihe nach ihrer Aussalzstärke angeordnet sind.
Selektivität und Auflösung
Die HIC-Selektivität ist orthogonal zur Ionenaustauschchromatographie und Größenausschlusschromatographie. Die Auflösung hängt vom Ligandentyp (Alkyl — Butyl, Octyl, Phenyl), der Ligandendichte, der Steigung des Salzgradienten und der Temperatur ab. Lineare Gradienten von 10–20 Säulenvolumina bieten typischerweise die beste Auflösung. Die Stufenelution wird für die Erfassung im Prozessmaßstab verwendet. Phenyl-Liganden bieten sowohl hydrophobe als auch aromatische Wechselwirkungen und sorgen für eine ausgeprägte Selektivität im Vergleich zu geradkettigen Alkyl-Liganden.
Säulenmedien
Gängige HIC-Harze umfassen Butyl- und Octyl-Sepharose (GE Healthcare), Phenyl- und Butyl-Toyopearl (Tosoh) sowie Macro-Prep-t-Butyl- und Methyl-HIC-Träger (Bio-Rad). Die Harze variieren in der Hydrophobie: Butyl > Octyl für Alkylketten bei äquivalenter Dichte. Partikelgrößen von 30–100 µm balancieren Auflösung und Flusseigenschaften für präparative Arbeiten.
Pufferüberlegungen
Beladungspuffer enthalten 1–2 M Ammoniumsulfat oder 3–4 M NaCl. Die Elution verwendet denselben Puffer ohne Salz. Die Senkung des pH-Werts oder die Zugabe von Ethylenglykol verringert die hydrophoben Wechselwirkungen für fest gebundene Proteine weiter. Detergenzien sollten vermieden werden, da sie die hydrophobe Bindung beeinträchtigen. Proben werden oft direkt durch Zugabe von festem Salz oder durch Verdünnung mit konzentrierten Salz-Stammlösungen eingestellt.
Methodenentwicklung
Beginnen Sie mit einer kleinen Screensäule (1 mL), die zwei oder drei Harzchemien bei zwei Salzkonzentrationen testet. Laden Sie 5–10 mg Protein pro mL Harz. Waschen Sie mit 5 Säulenvolumina Beladungspuffer. Eluieren Sie mit einem linearen Gradienten von 10 Säulenvolumina auf Null Salz. Sammeln Sie 1 mL-Fraktionen und analysieren Sie sie mittels SDS-PAGE. Optimieren Sie die Gradientensteigung für die Zielproteintrennung.
Anwendungen
HIC wird in der biopharmazeutischen Herstellung häufig als Zwischenreinigungs- oder Polierschritt eingesetzt. Es entfernt effektiv Aggregate, verkürzte Isoformen und Wirtszellproteine nach einem Erfassungsschritt wie Protein A oder IMAC. HIC ist besonders wirksam bei der Entfernung hydrophober Verunreinigungen, einschließlich Endotoxinen, DNA-gebundenen Proteinen und Viruspartikeln. Es wird häufig mit FPLC-Systemen für die automatisierte Methodendurchführung gekoppelt.
