Das Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist ein automatisierter Prozess, der große Mengen an Substanzen gegen biologische Zielstrukturen testet, um Ausgangspunkte für die Wirkstoffforschung oder die chemische Biologie zu identifizieren. Eine gut konzipierte HTS-Kampagne integriert Assay-Entwicklung, Automatisierung, Datenanalyse und Treffervalidierung.

Assay-Entwicklung

Die Grundlage jeder HTS-Kampagne ist ein robuster, reproduzierbarer Assay. Der Assay muss eine spezifische biologische Aktivität in einem für Automatisierung und Miniaturisierung geeigneten Format messen. Biochemische Assays verwenden gereinigte Proteine, um Enzyminhibition, Rezeptorbindung oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu messen. Zellbasierte Assays messen die Vitalität, Reportergenexpression oder phänotypische Veränderungen.

Zu den Schlüsselparametern bei der Assay-Entwicklung gehören das Signal-Rausch-Verhältnis, das Signal-Hintergrund-Verhältnis und der Z-Faktor, der die Assay-Qualität für HTS quantifiziert. Ein Z-Faktor über 0,5 zeigt einen ausgezeichneten Assay an. Der Variationskoeffizient sollte niedrig sein, typischerweise unter 10 %.

Die Assay-Miniaturisierung reduziert den Reagenzienverbrauch und erhöht den Durchsatz. Moderne HTS-Assays werden in 384-Well- oder 1536-Well-Platten mit Gesamtvolumina von 5–50 µL durchgeführt. Homogene Assays, die keine Waschschritte erfordern, werden wegen ihrer Geschwindigkeit und Einfachheit bevorzugt.

Nachweistechnologien

Fluoreszenzbasierte Auslesungen sind im HTS am häufigsten. Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) und zeitaufgelöster FRET (TR-FRET) werden weit verbreitet eingesetzt. Lumineszenz-Assays, einschließlich Firefly-Luciferase-basierter Reporter-Assays und Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET), bieten hohe Sensitivität und niedrigen Hintergrund.

Die AlphaScreen-Technologie verwendet bead-basierte Chemilumineszenz und ist besonders nützlich für den Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Absorptionsbasierte Assays sind einfach und robust, aber weniger sensitiv. Markierungsfreie Ansätze wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Massenspektrometrie können die Bindung direkt ohne fluoreszierende Markierungen nachweisen.

Substanzbibliotheken

HTS-Bibliotheken enthalten typischerweise hunderttausende bis Millionen von Substanzen. Diversitätsbibliotheken zielen darauf ab, einen breiten chemischen Raum abzudecken, während fokussierte Bibliotheken auf bestimmte Proteinfamilien wie Kinasen oder GPCRs abzielen. Fragmentbibliotheken enthalten niedermolekulare Verbindungen für das fragmentbasierte Screening.

Die Bibliotheksqualität wird anhand der Reinheit, Stabilität und physikochemischen Eigenschaften der Substanzen bewertet. Lipinskis Rule-of-Five leitet die wirkstoffähnlichen Eigenschaften: Molekulargewicht unter 500 Da, logP unter 5, nicht mehr als 5 Wasserstoffbrückendonoren und nicht mehr als 10 Wasserstoffbrückenakzeptoren. Pan-Assay-Interferenzverbindungen (PAINS) werden als häufige Treffer markiert, die durch unspezifische Mechanismen falsch-positive Ergebnisse erzeugen.

Automatisierung und Robotik

HTS basiert auf integrierten Robotersystemen, die die Plattenlagerung, Flüssigkeitsdosierung, Inkubation, Waschung und Detektion übernehmen. Plattenwascher, Mehrkanalpipetten und akustische Tröpfchenauswerfer ermöglichen eine präzise Flüssigkeitshandhabung im Nanoliterbereich. Die Umgebungskontrolle hält Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2-Werte für zellbasierte Assays aufrecht.

Der Screening-Durchsatz wird in Platten pro Tag oder Substanzen pro Woche gemessen. Eine typische HTS-Kampagne mit 100.000 Substanzen im 384-Well-Format erfordert etwa 260 Platten. Ultra-HTS-Plattformen können über 1 Million Substanzen pro Tag screenen.

Datenanalyse und Trefferauswahl

Die Daten des primären Screenings werden normalisiert und auf Platte-zu-Platte-Variationen korrigiert. Die prozentuale Inhibition oder Aktivität wird relativ zu positiven und negativen Kontrollen berechnet. Der Z-Score misst die Anzahl der Standardabweichungen vom Plattenmittelwert. Die Schwellenwerte für die Trefferauswahl werden typischerweise bei 3 Standardabweichungen über dem Mittelwert oder bei einem bestimmten prozentualen Inhibitionsgrenzwert festgelegt.

Die Trefferbestätigung beinhaltet erneutes Testen im primären Assay und Testen auf konzentrationsabhängige Aktivität. Gegen-Screenings eliminieren Substanzen, die eher mit der Nachweistechnologie als mit dem Ziel interagieren. Selektivitäts-Assays bewerten die Aktivität gegen verwandte Ziele. Promiskuitive Substanzen werden anhand ihrer flachen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Aktivität über mehrere nicht verwandte Assays hinweg identifiziert.

Treffer-zu-Leitstruktur und Leitstrukturoptimierung

Bestätigte Treffer durchlaufen eine medizinisch-chemische Optimierung (Leitstrukturoptimierung), um Wirksamkeit, Selektivität und wirkstoffähnliche Eigenschaften zu verbessern. Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studien (SAR) identifizieren die wichtigsten funktionellen Gruppen, die für die Aktivität verantwortlich sind. ADME-Profilierung (Absorption, Verteilung, Metabolismus, Exkretion) bewertet die pharmakokinetischen Eigenschaften. In-vivo-Wirksamkeitsstudien in Tiermodellen validieren das therapeutische Potenzial optimierter Leitstrukturen.