Immunfluoreszenz (IF) und Immunzytochemie (ICC) sind antikörperbasierte Techniken, die zeigen, wo sich ein Protein innerhalb einer Zelle auf subzellulärer Ebene befindet. IF verwendet fluoreszierende Farbstoffe; ICC verwendet chromogene Enzyme. Beide sind essenziell für die Zellbiologie, Pathologie und Wirkstoffforschung.

Direkte vs. Indirekte Methoden

Direkte IF: ein Primärantikörper ist direkt an einen Fluorophor konjugiert. Schnell (einmalige Inkubation) und niedriger Hintergrund, aber die Signalverstärkung ist begrenzt, da nur ein Antikörper pro Antigen bindet.

Indirekte IF: ein unkonjugierter Primärantikörper bindet das Ziel, und ein fluorophorkonjugierter Sekundärantikörper bindet den Primärantikörper. Es tritt eine Signalverstärkung auf, da mehrere Sekundärantikörper an jeden Primärantikörper binden. Dies ist der gebräuchlichste Ansatz, da er mit vielen Primärantikörpern derselben Wirtsspezies funktioniert.

Probenvorbereitung

1. Fixierung: bewahrt die Zellstruktur und immobilisiert Antigene. Paraformaldehyd (4% PFA, 15 Minuten bei Raumtemperatur) ist das gebräuchlichste Fixativ für IF. Es vernetzt Proteine über Aminogruppen. Methanol/Aceton-Fixierung ist schneller, kann aber die Morphologie verzerren und einige Epitope zerstören.
2. Permeabilisierung: ermöglicht Antikörpern den Zugang zu intrazellulären Antigenen. Triton X-100 (0,1–0,5 %) oder Saponin (0,1 %, schonender) für 10–15 Minuten. Überspringen Sie die Permeabilisierung, wenn nur Zelloberflächenantigene gefärbt werden.
3. Blockierung: inkubieren Sie mit 1–5 % BSA, 5–10 % Normalserum (von der Sekundärantikörper-Wirtsspezies) oder kommerziellem Blockierpuffer für 30–60 Minuten, um unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
4. Primärantikörper: inkubieren Sie in Blockierpuffer bei 4 °C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 1–2 Stunden. Optimieren Sie die Verdünnung empirisch.
5. Waschen: 3 × 5 Minuten in PBS.
6. Sekundärantikörper: inkubieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln (Fluorophore sind lichtempfindlich).
7. Waschen: 3 × 5 Minuten in PBS.
8. Gegenfärbung und Eindeckeln: DAPI oder Hoechst 33342 zur Kernfärbung (5 Minuten). Eindeckeln mit einem Anti-Fade-Eindeckelmedium.

Kontrollen

• Kontrolle ohne Primärantikörper: nur Sekundärantikörper — sollte keine spezifische Färbung zeigen.
• Isotypkontrolle: Primärantikörper durch einen unspezifischen Antikörper desselben Isotyps ersetzt.
• Blockierungspeptidkontrolle: Präinkubation des Primärantikörpers mit dem Immunisierungspeptid zur Aufhebung der spezifischen Färbung.
• Knockout-Kontrolle: Zellen ohne das Zielprotein bestätigen die Antikörperspezifität.

Multiplexing

Mehrere Proteine können gleichzeitig abgebildet werden, indem Primärantikörper verwendet werden, die in verschiedenen Wirtsspezies (Maus, Kaninchen, Ziege, Ratte) hergestellt wurden, mit speziesspezifischen Sekundärantikörpern, die an verschiedene Fluorophore konjugiert sind (DAPI (blau), Alexa 488 (grün), Alexa 568 (rot), Alexa 647 (fernrot)). Spektrale Entmischung oder Schmalbandfilter verhindern Übersprechen zwischen den Kanälen.

Bildaufnahme

Verwenden Sie ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop für dünne Proben oder Schnitte, ein Konfokalmikroskop für dickere Proben (optische Schnitte entfernen unscharfe Unschärfe) und ein strukturiertes Beleuchtungs- oder STED-Mikroskop für superauflösende Bildgebung unterhalb der Beugungsgrenze. Stellen Sie die Belichtungszeiten gegen die Kontrolle ohne Primärantikörper ein, um sicherzustellen, dass das spezifische Signal über dem Hintergrund liegt.