Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine markierungsfreie Technik, die direkt die Wärmeänderung misst, die eine Bindungsinteraktion begleitet. Sie ist die einzige Methode, die eine vollständige thermodynamische Charakterisierung der Bindung liefert, einschließlich der Assoziationsgleichgewichtskonstante (Ka), Gibbs-Energie (ΔG), Enthalpieänderung (ΔH), Entropieänderung (ΔS) und Bindungsstöchiometrie (n) aus einem einzigen Experiment.
In einem ITC-Experiment wird eine Ligandenlösung in kleinen Portionen in eine Probenkammer injiziert, die das Makromolekül bei konstanter Temperatur enthält. Jede Injektion erzeugt einen Wärmepuls, während Ligandenmoleküle an das Ziel binden. Wenn die Bindungsstellen gesättigt sind, nimmt das Wärmesignal ab, bis nur noch die Verdünnungswärme übrig bleibt. Die Referenzkammer enthält nur Puffer, und das Instrument misst die differentielle Leistung, die erforderlich ist, um identische Temperaturen zwischen den beiden Kammern aufrechtzuerhalten.
Das resultierende Thermogramm zeigt die Wärme pro Injektion über der Zeit auf. Die Integration jedes Peaks ergibt die kumulative freigesetzte oder absorbierte Wärme als Funktion des molaren Verhältnisses von Ligand zu Makromolekül. Die nichtlineare Regression der Bindungsisotherme mit einem geeigneten Bindungsmodell ergibt Ka, ΔH und n. ΔG wird aus Ka berechnet, und ΔS wird aus ΔG = ΔH - TΔS abgeleitet.
ITC kann Assoziationskonstanten von 103 bis 109 M−1 messen. Die Nachweisgrenze hängt von der Größe der Bindungsenthalpie und der Konzentration der Reaktanten ab. Typische Experimente erfordern 10–100 µM Konzentrationen des Makromoleküls in der Zelle und 10–100 mal höhere Ligandenkonzentration in der Spritze.
Zu den Überlegungen zum Versuchsdesign gehören die Optimierung des c-Wertes (Produkt aus Rezeptorkonzentration und Ka), die Auswahl der Injektionsvolumina und die Bestimmung der Verdünnungswärme durch Injektion des Liganden in reinen Puffer. Pufferzusammensetzung, pH-Wert und Temperatur müssen zwischen Probe und Referenz übereinstimmen.
Anwendungen umfassen die Charakterisierung von Enzym-Inhibitor-Wechselwirkungen, Protein-Protein-Bindung, Protein-DNA-Wechselwirkungen und Antikörper-Antigen-Erkennung. ITC misst auch Enzymkinetik, Membranprotein-Wechselwirkungen und die Bildung von Nanopartikel-Protein-Koronen.
