Übersicht
Die Microarray-Datenanalyse wandelt rohe Fluoreszenzintensitäten von hybridisierten Microarrays in aussagekräftige Genexpressionsmessungen um. Obwohl RNA-seq Microarrays für entdeckungsbasierte Studien weitgehend verdrängt hat, werden Microarrays aufgrund ihrer geringen Kosten, standardisierten Protokolle und gut etablierten Analysepipelines weiterhin häufig in der klinischen Diagnostik, Pflanzenzüchtung und großen Populationsstudien eingesetzt. Ein einzelner Mikroarray kann die Expression von Zehntausenden Transkripten gleichzeitig messen, indem er die komplementäre Basenpaarung zwischen Proben-cDNA und immobilisierten Sonden nutzt. Der Analyse-Workflow befasst sich mit den einzigartigen technischen Eigenschaften von Microarray-Daten, einschließlich Hintergrundkorrektur, Normalisierung und Zusammenfassung auf Sondenebene.
Methoden
Die Microarray-Analyse beginnt mit der Bildverarbeitung, um Intensitäten auf Sondenebene zu extrahieren. Hintergrundkorrektur entfernt unspezifische Signale mithilfe von Methoden wie robustem Multi-Array-Durchschnitt (RMA) oder GC-Inhaltsanpassung. Normalisierung macht Arrays vergleichbar: Quantilnormalisierung ist der gebräuchlichste Ansatz für einfarbige Arrays, während Lössnormalisierung auf zweifarbige Designs angewendet wird. Sondenzusammenfassung (für Affymetrix-Arrays mit RMA oder PLIER) kombiniert mehrere Sonden pro Gen zu einem einzigen Expressionswert. Qualitätsbewertung verwendet Pseudobilder, NUSE-Plots und RLE-Plots, um problematische Arrays zu identifizieren. Die differenzielle Expression wird mit Limma getestet, das empirische Bayes-Moderation verwendet, um Varianzschätzungen über Gene hinweg zu stabilisieren. Batch-Effekte werden mit der Hauptkomponentenanalyse erkannt und mit ComBat oder Limmas RemoveBatchEffect korrigiert.
Anwendungen
Trotz des Aufstiegs der Sequenzierung bieten Microarrays weiterhin einen Mehrwert. Die von der FDA zugelassenen Tests MammaPrint und Oncotype DX nutzen Mikroarrays für die Brustkrebsprognose. Klinische Panels zu DNA-Microarrays und Genexpression leiten Behandlungsentscheidungen in der Onkologie und Diagnose seltener Krankheiten. Die Microarray-Datenanalyse unterstützt auch die Validierung von qPCR-Ergebnissen durch qPCR Korrelationsstudien und ergänzt die DNA-Sequenzierung durch Profilierung der Expression im Maßstab. In der landwirtschaftlichen Genomik ermöglichen Microarrays eine kostengünstige Merkmalskartierung und markergestützte Selektion in großen Zuchtpopulationen.
Praktisches Protokoll
Beginnen Sie für die Affymetrix-Microarray-Analyse in R/Bioconductor mit dem Lesen von CEL-Dateien mit dem Paket „oligo“ oder „affy“. Erstellen Sie ein „ExpressionFeatureSet“: „data <- read.celfiles(list.celfiles())“. Führen Sie die RMA-Normalisierung in einem Schritt mit „eset <-rma(data)“ durch, das eine Hintergrundkorrektur (Faltung von Signal- und Rauschverteilungen), eine Quantilnormalisierung über Arrays hinweg und eine Zusammenfassung auf Sondenebene mittels Medianpolierung anwendet. Die resultierende Ausdrucksmatrix enthält log2-transformierte Werte, die zur Analyse bereitstehen. Bewerten Sie die Array-Qualität mit „NUSE“- (Normalized Unscaled Standard Error) und „RLE“-Diagrammen (Relative Log Expression). Arrays mit einem mittleren NUSE-Wert über 1,05 oder RLE-Interquartilbereichen, die von der Norm abweichen, sollten gekennzeichnet werden. Beim Testen von Differentialausdrücken wird „limma“ verwendet: Passen Sie zunächst ein lineares Modell mit „fit <- lmFit(eset, design)“ an, wobei „design“ eine Modellmatrix ist, die mit „model.matrix(~ condition)“ erstellt wurde. Wenden Sie dann die empirische Bayes-Moderation mit „fit2 <- eBayes(fit)“ an und extrahieren Sie die Ergebnisse mit „topTable(fit2, coef = 2, number = Inf, adjust = „BH“)“. Die Ausgabe umfasst Log-Fold-Änderungen, Durchschnittsausdruck, moderierte t-Statistiken, p-Werte und Benjamini-Hochberg-bereinigte p-Werte. Für zweifarbige Arrays verwenden Sie „limma“ mit „normalizeWithinArrays“ (Lößnormalisierung) und „normalizeBetweenArrays“ (Skalennormalisierung). In PCA-Plots identifizierte Batch-Effekte können mit „ComBat(dat, batch)“ aus dem „sva“-Paket korrigiert werden. Visualisieren Sie Ergebnisse mit Vulkandiagrammen, Heatmaps der am häufigsten differenziell ausgedrückten Sonden und MA-Diagrammen, um intensitätsabhängige Abweichungen zu überprüfen. Kommentieren Sie Sonden mit Genen mithilfe des plattformspezifischen Annotationspakets (z. B. „hgu133plus2.db“ für Human Genome U133 Plus 2.0-Arrays).
