Die traditionelle Restriktionsenzymklonierung wurde ergänzt — und in vielen Laboren ersetzt — durch rekombinatorische und modulare Assemblierungsmethoden, die schneller, nahtlos und mit Hochdurchsatz-Workflows kompatibel sind.

Gateway-Klonierung

Die Gateway-Klonierung verwendet das ortsspezifische Rekombinationssystem des Bakteriophagen Lambda. Zwei aufeinanderfolgende Rekombinationsreaktionen bewegen eine DNA-Sequenz zwischen Vektoren ohne Restriktionsenzyme oder Ligase.

In der BP-Reaktion rekombiniert ein PCR-Produkt, das von attB-Stellen flankiert wird, mit einem Donorvektor, der attP-Stellen enthält, und erzeugt einen Entry-Klon. Die LR-Reaktion transferiert dann das Insert vom Entry-Klon in einen beliebigen Zielvektor mit attR-Stellen. Der Zielvektor liefert die geeigneten Expressionselemente für den Zielorganismus.

Die Gateway-Klonierung ist gerichtet, verändert den Leserahmen nicht und erlaubt es, denselben Entry-Klon in mehrere Zielvektoren zu shuttlen (z. B. für Expression in Bakterien, Säugetierzellen oder Pflanzen). Ihre Hauptlimitierung ist die Größe der Rekombinationsstellen (etwa 50 bp pro Stelle), die zusätzliche Sequenz zum endgültigen Konstrukt hinzufügen.

Gibson Assembly

Die Gibson Assembly verbindet mehrere DNA-Fragmente in einer einzigen isothermalen Reaktion (50 °C, 15–60 Minuten). Sie erfordert drei enzymatische Aktivitäten:

• Eine 5′-Exonuklease verdaut die 5′-Enden zurück und hinterlässt überlappende einzelsträngige 3′-Überhänge.
• Eine DNA-Polymerase füllt die Lücken auf.
• Eine DNA-Ligase verschließt die Nickstellen.

Die Fragmente müssen an ihren Enden 15–40 bp überlappende Sequenz aufweisen, die typischerweise über PCR-Primer hinzugefügt wird. Die Gibson Assembly kann bis zu 10–15 Fragmente gleichzeitig verbinden und ist ideal für die Assemblierung großer Konstrukte wie synthetischer Gene, ganzer Plasmide oder Genome-Engineering-Kassetten. Die Assemblierung ist nahtlos — es bleiben keine Restriktionsstellen zurück.

Golden Gate Klonierung

Die Golden Gate Klonierung verwendet Typ-IIS-Restriktionsenzyme, die außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneiden und definierte 4-bp-Überhänge produzieren. Diese Überhänge können vom Benutzer festgelegt werden und sind so konzipiert, dass sie einzigartig und kompatibel sind.

Die Reaktion ist ein Eintopf-Verdau-Ligation: das Typ-IIS-Enzym und die T4-DNA-Ligase werden zusammen gegeben, und die Reaktion wird zwischen der optimalen Temperatur des Enzyms und 37 °C zykliert. Da die Erkennungsstellen nach dem Schneiden entfernt werden, ist das endgültig assemblierte Produkt nicht mehr verdaulich, was die Reaktion zu Ende treibt.

Golden Gate ist die Grundlage modularer Klonierungssysteme wie MoClo und der Plant Toolbox. Es ist ideal für die kombinatorische Assemblierung genetischer Teile (Promotoren, kodierende Sequenzen, Terminatoren) und für die Erstellung von TALEN-Arrays oder sgRNA-Bibliotheken.