Multiplex-PCR ist eine Variante der Standard-PCR (/guides/polymerase-chain-reaction.html), die mehrere DNA-Ziele in einer einzigen Reaktion amplifiziert. Durch die Einbeziehung mehrerer Primerpaare können Wissenschaftler mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig erkennen und analysieren und so Zeit, Reagenzien und Probenmaterial sparen.
Wie Multiplex-PCR funktioniert
- Primer-Design
Es werden mehrere Primerpaare entworfen, die jeweils für eine andere Zielsequenz spezifisch sind. Die Primer müssen ähnliche Schmelztemperaturen haben, um unter den gleichen Temperaturwechselbedingungen zu funktionieren. Jedes Amplifikat hat eine andere Größe, sodass die Produkte durch Gelelektrophorese unterschieden werden können.
- Reaktionsoptimierung
Der Ausgleich der Primerkonzentrationen ist entscheidend. Primer, die effizient amplifizieren, müssen möglicherweise reduziert werden, während schwache Primer möglicherweise erhöht werden müssen. Die Magnesiumkonzentration und die Annealing-Temperatur sind optimiert, um sicherzustellen, dass alle Ziele amplifiziert werden, ohne dass Primer-Dimere oder unspezifische Produkte entstehen.
- Verstärkung
Die Reaktion durchläuft standardmäßige thermische Zyklen. Alle Ziele werden gleichzeitig in derselben Röhre verstärkt. Der exponentielle Charakter der PCR bedeutet, dass selbst kleine Unterschiede in der Effizienz die relativen Mengen jedes Produkts beeinflussen können.
- Analyse
Die PCR-Produkte werden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Jedes Ziel erzeugt ein Band in seiner spezifischen Größe, das die Identifizierung der vorhandenen Ziele ermöglicht. Bei der quantitativen Multiplex-PCR ermöglichen Fluoreszenzsonden den Echtzeitnachweis jedes Ziels in verschiedenen Farbkanälen.
- Bewerbungen
Multiplex-PCR wird zum Nachweis von Krankheitserregern (Identifizierung mehrerer Viren oder Bakterien in einem Test), zum genetischen Screening, zur forensischen DNA-Profilierung und zur Genotypisierung eingesetzt. Die Möglichkeit, mehrere Ziele in einer Reaktion zu testen, macht es besonders wertvoll für die klinische Diagnostik.
Praktisches Multiplex-PCR-Design
Beginnen Sie mit der Auswahl von Primerpaaren für jedes Ziel mithilfe von Software wie Primer3 oder Primer-BLAST. Stellen Sie sicher, dass alle Primer eine Schmelztemperatur von weniger als 2–4 °C (normalerweise 58–62 °C) und einen GC-Gehalt von 40–60 % aufweisen. Auf Kreuzkompatibilität prüfen: Primer dürfen untereinander keine stabilen Primer-Dimere bilden, insbesondere nicht an den 3’-Enden. Verwenden Sie Tools wie AutoDimer oder das Multiplexing-Modul in Primer3, um Interaktionen auszuwerten. Stellen Sie die Amplikongrößen so ein, dass sie sich um mindestens 50–100 bp unterscheiden, damit sich die Produkte durch die Agarosegelelektrophorese klar auflösen. Für eine 4-Plex-Reaktion sollten Amplikons mit 150, 250, 400 und 600 bp angestrebt werden. Bereiten Sie einen Mastermix mit 1× PCR-Puffer, 1,5–3 mM MgCl2 (Optimierung in 0,5 mM-Schritten), 200 µM jedes dNTP, 0,1–1,0 µM jedes Primers (mit äquimolarer Menge beginnen und basierend auf der Bandenintensität anpassen), 1–100 ng Template-DNA und 1 U Taq-Polymerase vor. Führen Sie einen Temperaturgradienten (50–65 °C) durch, um die optimale Glühtemperatur zu ermitteln. Bewerten Sie Produkte durch Gelelektrophorese – die Banden sollten deutlich sein und nur minimale unspezifische Amplifikations- oder Primer-Dimer-Artefakte aufweisen. Wenn ein Ziel schlecht amplifiziert, erhöhen Sie seine Primerkonzentration und verringern Sie gleichzeitig die Anzahl der überamplifizierenden Ziele.
Reale Anwendung
In Atemwegspathogen-Panels erkennt die Multiplex-PCR SARS-CoV-2, Influenza A/B und Respiratory Syncytial Virus in einer einzigen Reaktion unter Verwendung von vier Primerpaaren mit unterschiedlich großen Amplifikaten. Der Assay wird in einem 96-Well-Plattenformat mit Kontrollen in jedem Lauf durchgeführt. Die Ergebnisse liegen innerhalb von 2–3 Stunden vor und ermöglichen schnelle Triage- und Behandlungsentscheidungen während der Grippesaison und bei Pandemieausbrüchen.
