Native PAGE

Im Gegensatz zur SDS-PAGE trennt die native (nicht-denaturierende) PAGE Proteine in ihrer nativen Konformation ohne SDS oder Reduktionsmittel. Die Migrationsrate hängt sowohl von der Größe des Proteins als auch von seiner intrinsischen Ladung ab, was die Molekulargewichtsbestimmung weniger direkt macht als bei der SDS-PAGE — aber die enzymatische Aktivität und Protein-Protein-Interaktionen bleiben erhalten.

Puffer: Das gebräuchlichste System ist das Laemmli-Puffersystem ohne SDS. Das Trenngel hat pH 8,8 und das Sammelgel pH 6,8, beide mit Tris-Glycin-Laufpuffer. Proteine tragen bei dem Lauf-pH eine negative Nettoladung und wandern zur Anode.

Blue Native PAGE (BN-PAGE): Coomassie Blau G-250 wird zum Kathodenpuffer und zur Proteinprobe gegeben. Der Farbstoff bindet an hydrophobe Oberflächen und verleiht eine gleichmäßige negative Ladung, ohne die Proteine zu denaturieren. Dies ermöglicht die Trennung von Membranproteinkomplexen (z. B. Atmungskettensuperkomplexe), die unter nativen Standardbedingungen unlöslich sind.

Anwendungen:

• Bestimmung des oligomeren Zustands von Proteinen (Monomer, Dimer, Tetramer).
• Analyse von Multiproteinkomplexen mittels Western Blot oder Massenspektrometrie nach In-Gel-Verdau (native PAGE gefolgt von 2D-SDS-PAGE).
• Nachweis von Enzymisoformen mit unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten.
• Qualitätskontrolle für die Proteinreinigung (Aggregationsbeurteilung).

Einschränkungen: Die Auflösung ist im Allgemeinen niedriger als bei SDS-PAGE. Saure und basische Proteine ko-migrieren im selben Gelsystem schlecht. Die Kalibrierung mit nativen Molekulargewichtsmarkern ergibt nur ungefähre Größen.

Zymographie

Die Zymographie weist die Enzymaktivität direkt in einem Polyacrylamidgel nach, indem ein Substrat in das Trenngel co-polymerisiert wird. Nach der Elektrophorese wird das Gel in einem Renaturierungspuffer inkubiert, um die Enzymaktivität wiederherzustellen, dann gefärbt. Die Enzymaktivität erscheint als klares Band vor einem dunklen Hintergrund, wo das Substrat abgebaut wurde.

Arten der Zymographie:

• Gelatine-Zymographie: Gelatine (denaturiertes Kollagen) wird bei 0,1 % eingearbeitet. Verwendet für Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Nach der Inkubation wird das Gel mit Coomassie Blau gefärbt — MMP-Aktivität erscheint als weiße/transparente Banden auf blauem Hintergrund.
• Casein-Zymographie: Casein ist das Substrat. Verwendet für Serinproteasen und Plasminogenaktivatoren.
• Reverse Zymographie: das Gel enthält sowohl das Substrat als auch einen Inhibitor. Inhibitoraktivität erscheint als dunkle Banden, wo das Substrat vor Abbau geschützt ist.
• In-Gel-Kinase-Assays: das Gel wird mit einem Proteinkinasesubstrat polymerisiert, und nach Elektrophorese, Renaturierung und Inkubation mit [γ-³²P]ATP werden phosphorylierte Banden durch Autoradiographie nachgewiesen.

Protokollzusammenfassung für Gelatine-Zymographie:

1. Bereiten Sie das Trenngel mit 0,1 % Gelatine (und SDS) vor.
2. Laden Sie Proben unter nicht-reduzierenden Bedingungen (nicht kochen, keine Reduktionsmittel — diese denaturieren MMPs).
3. Führen Sie die Elektrophorese bei 4 °C durch, um vorzeitige Proteolyse zu verhindern.
4. Entfernen Sie SDS durch Waschen des Gels in 2,5 % Triton X-100 für 30 Minuten (2 Mal).
5. Inkubieren Sie in Entwicklungspuffer (50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, 0,15 M NaCl, pH 7,5) bei 37 °C für 16–48 Stunden.
6. Färben Sie mit Coomassie Blau und entfärben Sie.

Die Zymographie ist hoch empfindlich (Nachweis von Pikogramm-Mengen aktiven Enzyms) und kann zwischen Pro-Enzym (latent) und aktiven Formen basierend auf dem Molekulargewicht unterscheiden.