Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat zahlreiche spezialisierte Varianten und Anwendungen hervorgebracht, die ihren Nutzen über die einfache DNA-Amplifikation hinaus erweitern. Diese Techniken ermöglichen Mutationsdetektion, Methylierungsanalyse, Molekulardiagnostik und forensische Identifizierung.

Allelspezifische PCR

Die allelspezifische PCR unterscheidet zwischen DNA-Sequenzen, die sich in einem einzelnen Nukleotid unterscheiden. Die Methode verwendet Primer, deren 3’-terminale Base an der polymorphen Stelle positioniert ist. Wenn die terminale Base mit der Matrize übereinstimmt, läuft die Amplifikation effizient ab. Bei Fehlpaarung wird die Verlängerung blockiert oder stark reduziert. Durch die Verwendung von zwei für jedes Allel spezifischen Primern in getrennten Reaktionen kann der Genotyp bestimmt werden. Die Technik wird häufig zur Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen und zum Nachweis krankheitsassoziierter Mutationen wie Faktor-V-Leiden und Prothrombin G20210A verwendet.

Methylierungsspezifische PCR

Die methylierungsspezifische PCR detektiert DNA-Methylierungsmuster, die wichtige epigenetische Marker bei Krebs und Entwicklung sind. Genomische DNA wird mit Natriumbisulfit behandelt, das unmethylierte Cytosine in Uracil umwandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Die PCR mit Primern, die zur Unterscheidung der konvertierten und nicht konvertierten Sequenzen entwickelt wurden, bestimmt dann den Methylierungsstatus von CpG-Stellen. Die Technik wird zum Nachweis aberranter Promotor-Methylierung in Tumorsuppressorgenen und für die Prägemusteranalyse verwendet.

Inverse PCR

Die inverse PCR amplifiziert DNA-Regionen, die eine bekannte Sequenz flankieren, und ist nützlich für die Identifizierung von Insertionsstellen oder die Charakterisierung unbekannter flankierender Regionen. Genomische DNA wird mit einem Restriktionsenzym verdaut, das außerhalb der bekannten Region schneidet, und die Fragmente werden durch Ligation zirkularisiert. Die PCR mit Primern, die von der bekannten Sequenz nach außen gerichtet sind, amplifiziert dann die unbekannte flankierende DNA über die Ligationsverbindungsstelle. Die inverse PCR wurde zur Charakterisierung von Transposon-Insertionsstellen und viralen Integrationsstellen im Genom verwendet.

Degenerierte PCR

Die degenerierte PCR verwendet Primer-Pools, die gemischte Basen an bestimmten Positionen enthalten, um verwandte Gene aus verschiedenen Arten oder Mitglieder einer Genfamilie zu amplifizieren. Primer werden aus konservierten Aminosäuresequenzen entwickelt, wobei Degeneration an Codon-Wobble-Positionen eingeführt wird. Die Technik wird verwendet, um homologe Gene aus neuen Arten zu klonieren, Genfamilienmitglieder zu identifizieren und Pathogene mit variablen Sequenzen zu detektieren. Touchdown-PCR, bei der die Annealing-Temperatur schrittweise gesenkt wird, verbessert die Spezifität bei degenerierter PCR.

Anwendungen der quantitativen PCR

Die quantitative PCR (qPCR) geht über die Messung der Genexpression hinaus. Die Kopienzahlvariationsanalyse verwendet qPCR, um Gendeletionen oder -amplifikationen durch Vergleich der Amplifikation eines Zielgens mit einem Referenzgen zu detektieren. Die Technik wird beim HER2-Test für Brustkrebs und zum Nachweis chromosomaler Anomalien verwendet. Die Pathogendetektion verwendet qPCR zur Quantifizierung der Viruslast bei HIV-, Hepatitis-B- und Hepatitis-C-Patienten und leitet Behandlungsentscheidungen. Der GVO-Nachweis quantifiziert die Menge an genetisch verändertem Material in Lebensmitteln.

Anwendungen der digitalen PCR

Die digitale PCR ermöglicht eine absolute Quantifizierung ohne Standardkurven. Sie wird zum Nachweis seltener Mutationen in zirkulierender Tumor-DNA verwendet und ermöglicht die Flüssigbiopsie für die Krebsüberwachung. Die digitale PCR detektiert auch Resterkrankungen nach der Behandlung, identifiziert fetale Aneuploidien aus mütterlichem Blut und charakterisiert Kopienzahlvariationen mit hoher Präzision. Die hohe Empfindlichkeit der digitalen PCR ermöglicht den Nachweis von Mutantenallelhäufigkeiten unter 0,1 %.

Forensische PCR

Die Kurztandemwiederholungs-Analyse unter Verwendung von Multiplex-PCR ist die Standardmethode für die menschliche Identifizierung in der Forensik. Kommerzielle Kits amplifizieren 15 bis 20 STR-Loci plus den Amelogenin-Geschlechtsbestimmungsmarker in einer einzigen Reaktion. Die amplifizierten Fragmente werden durch Kapillarelektrophorese aufgetrennt und die Allelgrößen bestimmt. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei nicht verwandte Personen dasselbe STR-Profil teilen, liegt typischerweise unter eins zu einer Milliarde. Die Touch-DNA-Analyse ermöglicht die Profilerstellung aus winzigen Proben, die nur wenige Zellen enthalten.

Einzelzell-PCR

Die Einzelzell-PCR amplifiziert das Genom oder Transkriptom einzelner Zellen und zeigt Heterogenität auf, die in der Bulk-Analyse maskiert wird. Die Technik beginnt mit der Zellisolierung durch Mikromanipulation, Durchflusssortierung oder Mikrofluidik. Die Gesamtgenom-Amplifikation unter Verwendung von Multipler-Displacement-Amplifikation oder PCR-basierten Methoden erhöht die DNA-Menge für nachfolgende Analysen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet reverse Transkription und PCR-Amplifikation, um die Genexpression in einzelnen Zellen zu profilieren und Zelltypen, -zustände und Entwicklungsverläufe aufzudecken.