Übersicht
Phosphoproteomics ist die groß angelegte Untersuchung der Proteinphosphorylierung – einer der weitverbreitetsten und funktionell wichtigsten posttranslationalen Modifikationen. Phosphorylierung reguliert nahezu jeden Aspekt des Zelllebens, einschließlich Enzymaktivität, Protein-Protein-Wechselwirkungen, subzelluläre Lokalisierung und Signaltransduktion. Ziel der Phosphoproteomik ist es, herauszufinden, welche Proteine an welchen Resten (hauptsächlich Serin, Threonin und Tyrosin) phosphoryliert werden und wie sich der Phosphorylierungsstatus als Reaktion auf Reize ändert. Das Fachgebiet kombiniert Phosphopeptid-Anreicherungsstrategien mit hochauflösender Massenspektrometrie und spezialisierter Bioinformatik, um das Phosphoproteom in beispielloser Tiefe abzubilden.
Schlüsselkonzepte
Phosphopeptidanreicherung ist wichtig, da phosphorylierte Peptide im Vergleich zu ihren nicht phosphorylierten Gegenstücken typischerweise unterstöchiometrisch sind. Zu den gängigen Anreicherungsmethoden gehören die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) und die Titandioxid-Chromatographie (TiO2), die beide die Affinität von Phosphatgruppen zu Metalloxiden ausnutzen. Ortslokalisierungsalgorithmen wie Ascore, Mascot Delta Score und die Lokalisierungswahrscheinlichkeit von MaxQuant bestimmen den genauen Rest, der das Phosphat trägt. Motivanalyse identifiziert Sequenzmuster rund um Phosphorylierungsstellen, um auf vorgelagerte Kinasepräferenzen zu schließen. Aus diesen Motiven können Kinase-Substrat-Beziehungen vorhergesagt und experimentell validiert werden.
Praktisches Protokoll
Ein Standard-Phosphoproteomics-Arbeitsablauf beginnt mit der Proteinextraktion und -verdauung. Zellen oder Gewebe werden in denaturierendem Puffer, der Phosphataseinhibitoren (z. B. Natriumorthovanadat, Beta-Glycerophosphat) enthält, lysiert, um den Phosphorylierungsstatus aufrechtzuerhalten. Proteine werden über Nacht mit Trypsin verdaut und die resultierende Peptidmischung mit C18-Kartuschen entsalzt. Es folgt der entscheidende Anreicherungsschritt: Die Peptidmischung wird auf eine TiO2- oder IMAC-Säule geladen, wo Phosphopeptide über ihre Phosphatgruppen an das Metalloxid oder immobilisierte Metallionen binden. Nicht phosphorylierte Peptide werden mit Puffern, die 80 % Acetonitril und 0,5 % Trifluoressigsäure enthalten, abgewaschen, während Phosphopeptide mit einem alkalischen Phosphatpuffer oder einer 5 %igen Ammoniaklösung eluiert werden. Die angereicherte Fraktion wird mittels LC-MS/MS oder CE-MS unter Verwendung von Kapillarzonenelektrophorese auf einem hochauflösenden Orbitrap-Massenspektrometer analysiert. Rohdaten werden mit MaxQuant verarbeitet, wobei die Phosphorylierung von Serin, Threonin und Tyrosin als variable Modifikationen festgelegt wird. Standort-Lokalisierungswahrscheinlichkeitswerte von MaxQuant bestimmen den genauen phosphorylierten Rest. Die nachgelagerte Analyse umfasst die Motivanreicherung mithilfe von Tools wie IceLogo zur Identifizierung von Kinase-Konsensussequenzen und zur Inferenz des Kinase-Substrat-Netzwerks mithilfe der Kinase-Substrate Enrichment Analysis (KSEA). In einer realen Anwendung kartierte dieser Arbeitsablauf über 20.000 Phosphosites in EGF-stimulierten HeLa-Zellen und enthüllte die dynamische Phosphorylierung des EGFR-Signalnetzwerks innerhalb von Minuten nach der Stimulation. Ein weiteres Beispiel ist die systematische Kartierung des DNA-Schadensreaktions-Phosphoproteoms, bei dem 5.000 regulierte Phosphosites ATM- und ATR-Kinase-Substrate identifizierten, die für die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints und die DNA-Reparatur entscheidend sind.
Anwendungen
Die Phosphoproteomik ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis von Netzwerken der Zellsignalisierung. Es hat die Signalkaskaden stromabwärts von [Rezeptor-Tyrosinkinasen] (/guides/receptor-tyrosine-kinases.html) und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren kartiert, eine Kreuzkopplung mit [Second Messenger]-Pfaden (/guides/second-messengers.html) aufgedeckt und die JAK-STAT Signalisierung Achse. In der Krebsforschung identifiziert die Phosphoproteomik abnormal aktive Kinasen, die als therapeutische Ziele dienen können, und ermöglicht präzise onkologische Ansätze, die Inhibitoren den fehlregulierten Signalknoten zuordnen, die das Tumorwachstum vorantreiben.
