Unter Enzymhistochemie versteht man die Untersuchung der Enzymaktivität in Gewebeschnitten. Im Gegensatz zur Immunhistochemie, die das Vorhandensein von Enzymprotein (ob aktiv oder inaktiv) nachweist, erkennt die Enzymhistochemie die funktionale Aktivität – die Fähigkeit des Enzyms, seine spezifische Reaktion zu katalysieren. Diese funktionellen Informationen sind für Krankheitszustände oft relevanter als das bloße Vorhandensein von Proteinen.
Prinzipien
Die Enzymhistochemie beruht auf einer Einfangreaktion, bei der das Produkt der enzymkatalysierten Reaktion am Ort der Aktivität ausgefällt wird. Ein Gewebeschnitt wird in einer Substratlösung inkubiert, die das spezifische Substrat des Enzyms und ein Einfangreagenz enthält. Das Enzym wandelt das Substrat um; Das Reaktionsprodukt wird vom Reagenz eingefangen und bildet einen unlöslichen, farbigen Niederschlag, der unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist.
Die Reaktion muss: spezifisch sein (das Enzym muss das einzige sein, das das Substrat unter den verwendeten Bedingungen nutzen kann); das Produkt muss unlöslich sein (um am Wirkungsort zu verbleiben); und der Niederschlag muss sichtbar sein (farbig, fluoreszierend oder elektronendicht für ultrastrukturelle Lokalisierung).
Fixierung und Erhaltung der Enzymaktivität
Die Fixierung ist die kritischste Variable in der Enzymhistochemie. Formalin und andere vernetzende Fixiermittel hemmen die meisten Enzyme – der Grad der Hemmung hängt von der Fixierungszeit, der Temperatur und dem spezifischen Enzym ab. Eine kurze Fixierung (2–4 Stunden in kaltem Formalin oder Formol-Kalzium) bewahrt einen Teil der Enzymaktivität und behält gleichzeitig eine angemessene Morphologie bei. Unfixierte Gefrierschnitte (Kryostatschnitte aus schockgefrorenem Gewebe) bieten die höchste Enzymaktivität, aber eine schlechtere Morphologie.
Kaltfixierung (4°C) reduziert die Enzyminaktivierung. Aceton-Fixierung (4°C, 30-60 Minuten) konserviert viele Enzyme besser als Formalin. Keine Fixierung – frisch gefrorene Schnitte können für Enzyme verwendet werden, die durch jedes Fixiermittel vollständig inaktiviert werden. Die Nachfixierung (zuerst den Abschnitt für die Enzymreaktion inkubieren und dann fixieren) ist ein alternativer Ansatz.
Erkennungsmethoden
Gleichzeitiges Einfangen – die Enzymreaktion und die Einfangfällung erfolgen gleichzeitig. Das Substrat und das Einfangreagenz werden im Inkubationsmedium gemischt. Die meisten Hydrolasen (saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Esterasen) werden durch gleichzeitiges Einfangen unter Verwendung eines Diazoniumsalzes als Einfangreagenz nachgewiesen.
Kopplung nach der Inkubation – die Enzymreaktion erzeugt ein primäres Reaktionsprodukt, das dann in einem zweiten Schritt mit einem Einfangreagenz gekoppelt wird. Diese Methode wird für Enzyme verwendet, bei denen das Primärprodukt instabil ist oder bei denen das Einfangreagens die Enzymaktivität beeinträchtigt.
Metallsalzmethoden – das Enzymreaktionsprodukt (z. B. Phosphat aus der Phosphataseaktivität) wird von einem Metallion (Blei, Kobalt, Kupfer) eingefangen, um ein unlösliches, elektronendichtes Metallsalz zu bilden. Diese Methoden sind sowohl mit der Licht- als auch mit der Elektronenmikroskopie kompatibel.
Tetrazoliumsalz-Methoden – werden für Dehydrogenasen und Oxidoreduktasen verwendet. Das Enzym überträgt Elektronen auf NAD(P) oder FAD, das dann ein Tetrazoliumsalz zu einem farbigen, unlöslichen Formazan-Niederschlag reduziert. Verschiedene Tetrazoliumsalze (NBT, MTT, INT) erzeugen verschiedenfarbige Formazane (blau, lila, rot).
Steuerelemente
Kontrollen sind für die Validierung histochemischer Enzymreaktionen unerlässlich. Positive Kontrolle – ein Gewebe, von dem bekannt ist, dass es das Enzym enthält (Leber für die meisten Stoffwechselenzyme, Niere für Phosphatasen, Skelettmuskel für Dehydrogenasen). Negativkontrolle – das gleiche Gewebe, inkubiert ohne Substrat, mit einem spezifischen Enzyminhibitor oder mit hitzeinaktiviertem Enzym (gekochter Schnitt). Inhibitionskontrollen mit spezifischen Enzyminhibitoren (z. B. Natriumfluorid für saure Phosphatase) bestätigen, dass die Reaktion auf das Zielenzym und nicht auf ein kreuzreagierendes Enzym zurückzuführen ist.
Anwendungen
Enzymhistochemie wird in der Muskelpathologie (Muskelfasertypisierung durch ATPase- und NADH-TR-Reaktionen – wesentlich für die Diagnose von Myopathien), Leberpathologie (Enzymmangel bei metabolischer Lebererkrankung), Nierenpathologie (Enzymmuster bei tubulären Verletzungen) und Tumorpathologie (alkalische Phosphatase bei Osteosarkomen, unspezifische Esterase bei histiozytären Tumoren) eingesetzt. Während IHC viele Anwendungen der Enzymhistochemie ersetzt hat, bleibt die Enzymhistochemie für den Nachweis funktioneller Enzymaktivität, insbesondere bei der Diagnose von Muskel- und Stoffwechselerkrankungen, unersetzlich. Qualitätssicherung umfasst die regelmäßige Validierung der Enzymaktivität mithilfe von Positiv- und Negativkontrollen.
