Protein A und Protein G sind bakterielle Immunglobulin-bindende Proteine, die an die Fc-Region von Antikörpern binden und eine schnelle, einstufige Reinigung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern aus Serum, Aszitesflüssigkeit oder Zellkulturüberständen ermöglichen.
Prinzip
Protein A (aus Staphylococcus aureus) und Protein G (aus Streptococcus sp.) binden spezifisch an die Fc-Region von IgG-Antikörpern, ohne die antigenbindende Fab-Region zu erkennen. Dies erhält die Antikörperfunktionalität nach der Reinigung. Die bakteriellen Proteine werden auf Agarose oder Magnetkügelchen immobilisiert und als Affinitätserfassungs-Reagenzien verwendet. Antikörper binden bei physiologischem pH-Wert und werden bei niedrigem pH-Wert (2,5–3,0) eluiert, der die Fc-Protein A/G-Interaktion stört. Eluierte Fraktionen werden sofort neutralisiert, um eine säurekatalysierte Denaturierung zu verhindern.
Protein A vs. Protein G
Protein A bindet humane IgG-Subklassen mit unterschiedlicher Affinität: stark an IgG1, IgG2 und IgG4, aber schwach an IgG3. Es bindet auch Kaninchen-, Schweine-, Hunde- und Meerschweinchen-IgG gut, aber schlecht an Ziegen-, Schaf-, Ratten- und Maus-IgG1. Protein G bindet ein breiteres Spektrum von IgG-Subklassen über Spezies hinweg, einschließlich aller humanen IgG-Subklassen, Maus-IgG1, Ziegen-, Schaf- und Ratten-IgG. Protein A/G ist ein rekombinantes Fusionsprotein, das die Bindungsdomänen beider kombiniert und die breiteste Spezies- und Subklassenabdeckung bietet. Die Wahl hängt von der Antikörperspezies und dem Isotyp ab. Für die meisten polyklonalen Seren bietet Protein A/G-Agarose die beste Ausbeute.
Harzformate
Protein A, Protein G und Protein A/G sind an Agarose, Sepharose und Magnetkügelchen gekoppelt erhältlich. Protein A Sepharose (Cytiva) und MabSelect SuRe (ein alkalistabilisiertes Protein A-Derivat) sind Standards für die monoklonale Antikörperreinigung. Rekombinante Protein A-Varianten mit verbesserter Alkalistabilität ermöglichen die Reinigung mit 0,1–0,5 M NaOH zur Endotoxin-Entfernung. Die Bindungskapazität reicht von 5–20 mg humanem IgG pro mL Harz, abhängig vom Harz und den Flussbedingungen. Hochkapazitätsharze (30–50 mg/mL) werden für die Bioproduktion verwendet.
Puffersystem
Beladungspuffer: 20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4 (PBS) oder 20 mM Tris-HCl, pH 7,5–8,0. Waschpuffer: gleiche Zusammensetzung wie Beladung, manchmal mit 0,1 % Tween-20 oder 1 M NaCl für stringentes Waschen. Elutionspuffer: 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,5–3,0, oder 0,1 M Citrat, pH 3,0. Neutralisationspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 8,5–9,0 (50–100 µL pro mL Eluat zugeben). Für die schonende Elution können 2–3 M MgCl₂ oder 3,5 M KSCN verwendet werden, obwohl diese Chaotrope einige Antikörper beeinträchtigen können.
Protokoll
Protein A/G-Harz mit Beladungspuffer äquilibrieren. Geklärtes Serum (1:1 in Beladungspuffer verdünnt) oder Kulturüberstand (bei niedrigem Titer 10-fach konzentriert) bei 0,5–1 mL/min laden oder 30 min bei 4 °C im Batch rotieren. Mit 10–15 Säulenvolumina Beladungspuffer waschen, bis A₂₈₀ die Basislinie erreicht. Mit 5–10 Säulenvolumina Elutionspuffer eluieren, 0,5–1 mL-Fraktionen in Röhrchen mit Neutralisationspuffer sammeln. Die A₂₈₀-Peakfraktionen poolen und in PBS oder Lagerpuffer dialysieren oder umpuffern. SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zeigt 25 kDa (Leichtkette) und 50 kDa (Schwerkette) Banden.
Affinitätsreifung und entwickelte Varianten
Rekombinante Protein A-Varianten (MabSelect SuRe, ProSep Ultra Plus) werden für höhere Bindungskapazität, verbesserte Alkalistabilität (>0,5 M NaOH-Toleranz für die Reinigung vor Ort) und reduziertes Ligandenauswaschen entwickelt. Diese Harze sind für die biopharmazeutische Herstellung unerlässlich, wo Säulenwiederverwendung (>100 Zyklen) und strenge Reinheitsanforderungen gelten.
Anwendungen
Die Protein A/G-Reinigung ist der Goldstandard für die Antikörperreinigung in Forschung und Industrie. Monoklonale Antikörper aus Hybridoma-Überständen, polyklonale Antikörper aus Kaninchen- oder Ziegenserum und humane therapeutische monoklonale Antikörper aus CHO-Zellkulturen werden routinemäßig mit dieser Methode gereinigt. Die Immunpräzipitation von Antikörper-Antigen-Komplexen verwendet Protein A/G-Magnetkügelchen, um den Antikörper zusammen mit seinem gebundenen Antigen zu erfassen. Für Hochdurchsatzformate wird Protein A/G in multiplexierter Affinitätserfassung und 96-Well-Platten-Antikörperscreening verwendet.
