Übersicht
Proteomik-Bioinformatik ist die Computerdisziplin, die rohe Massenspektrometriedaten in biologisches Wissen über Proteine umwandelt. Es befasst sich mit der immensen Komplexität des Proteoms – Tausenden von Proteinen, von denen jedes potenziell mehrere posttranslationale Modifikationen, Spleißvarianten und Abbauprodukte trägt. Das Fachgebiet entwickelt Algorithmen zur Peptididentifizierung, Proteininferenz, Quantifizierung und statistischen Validierung. Durch die Umwandlung von Spektralsignalen in identifizierte und quantifizierte Proteine ermöglicht die Proteomik-Bioinformatik Forschern, Fragen auf Systemebene über Zellfunktionen, Krankheitsmechanismen und Arzneimittelreaktionen zu stellen.
Schlüsselkonzepte
Im Mittelpunkt des Fachgebiets steht das Datenbanksuchparadigma, bei dem experimentelle Tandem-Massenspektren mit theoretischen Spektren verglichen werden, die aus einer Proteinsequenzdatenbank abgeleitet wurden. Algorithmen wie SEQUEST, Mascot und MS-GF+ weisen Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSMs) mithilfe von Bewertungsfunktionen zu, die Fragmentionenreihen und Vorläufermasse berücksichtigen. Die False Discovery Rate (FDR)-Schätzung mittels Ziel-Köder-Suche steuert die Fehlerrate von Identifizierungen. Proteininferenz befasst sich mit dem Problem gemeinsamer Peptide – Peptide, die mehreren Proteinen gemeinsam sind – unter Verwendung von Sparprinzipien und Bayes’schen Ansätzen.
Praktisches Protokoll
Ein praktischer Arbeitsablauf für die Datenbanksuche beginnt mit dem Laden roher Massenspektrometriedateien (.raw, .wiff oder .d) in MaxQuant oder Proteome Discoverer. Der Forscher spezifiziert die Proteinsequenzdatenbank, typischerweise das UniProt-Proteom von Mensch oder Maus, an das häufige Verunreinigungen wie Keratine und Trypsin angehängt sind. Trypsin wird als Verdauungsenzym eingesetzt und ermöglicht bis zu zwei fehlende Spaltungen. Die Vorläufer-Massentoleranz ist für Orbitrap-Daten auf 10 ppm und die Fragment-Massentoleranz auf 0,5 Da für Ionenfallen oder 20 ppm für Orbitrap eingestellt. Die Carbamidomethylierung von Cystein wird als feste Modifikation festgelegt; Oxidation von Methionin und N-terminale Acetylierung als variable Modifikationen. Die Falscherkennungsrate wird mithilfe einer Ziel-Täuschungsdatenbank gesteuert: Eine Täuschungsdatenbank mit umgekehrten Sequenzen wird mit der Zieldatenbank verkettet, und Peptidspektrum-Übereinstimmungen werden auf Peptidebene auf 1 % FDR gefiltert. Bei der Proteininferenz wird das Sparsamkeitsprinzip verwendet – es wird der minimale Satz an Proteinen angegeben, der alle identifizierten Peptide erklärt. Intensitäten der markierungsfreien Quantifizierung (LFQ) werden aus summierten extrahierten Ionenströmen zugewiesener Peptide berechnet. Die resultierende Proteingruppentabelle wird für statistische Tests in Perseus oder R exportiert. In einer Studie zum Vergleich von gesundem und fibrotischem Lebergewebe identifizierte diese Pipeline beispielsweise 4.500 Proteine mit 98 % Vollständigkeit in sechs biologischen Replikaten. Über 300 Proteine waren unterschiedlich häufig anzutreffen, darunter extrazelluläre Matrixproteine, die mithilfe unabhängiger, auf Antikörpern basierender Tests als Fibrose-Biomarker validiert wurden. Der gleiche Arbeitsablauf wird routinemäßig in der klinischen Proteomik zur Klassifizierung von Tumorsubtypen aus FFPE-Gewebeproben angewendet.
Anwendungen
Die Bioinformatik der Proteomik wird bei der Entdeckung von Biomarkern eingesetzt, wobei die unterschiedliche Proteinexpression zwischen gesunden und erkrankten Geweben auf diagnostische Kandidaten untersucht wird. Es unterstützt die Identifizierung von Wirkstoffzielen, indem es Veränderungen der Proteinhäufigkeit bei der Behandlung mit Wirkstoffen profiliert. Das Fachgebiet unterstützt auch die Charakterisierung von [posttranslationalen Modifikationen] (/guides/post-translational-modifications.html) und lässt sich in Arbeitsabläufe für [Proteomik und Massenspektrometrie] (/guides/proteomics-and-mass-spectrometry.html) integrieren. Daten aus Massenspektrometrie-Experimenten werden über Pipelines verarbeitet, die auch Ergebnisse aus der Proteinextraktion und -reinigung einbeziehen, um sicherzustellen, dass sich die Probenqualität in der endgültigen Analyse widerspiegelt.
