Reportergen-Assays sind ein Eckpfeiler der Molekularbiologie zur Untersuchung der Genregulation. Ein Reportergen kodiert für ein Protein, dessen Aktivität leicht messbar ist, und wird unter die Kontrolle eines Promotors oder regulatorischen Elements von Interesse gestellt.
Gebräuchliche Reporter
- Glühwürmchen-Luciferase (aus Photinus pyralis): katalysiert die Oxidation von D-Luciferin und erzeugt Licht bei 560 nm. Das Signal wird mit einem Luminometer gemessen. Es hat einen sehr hohen dynamischen Bereich (7–8 Größenordnungen) und praktisch keinen Hintergrund in Säugetierzellen.
- Renilla-Luciferase (aus Renilla reniformis): verwendet Coelenterazin als Substrat und emittiert bei 480 nm. Sie wird häufig als Kontrollreporter zur Normalisierung in Dual-Luciferase-Assays verwendet.
- Grün fluoreszierendes Protein (GFP): aus Aequorea victoria, fluoresziert bei 509 nm bei Anregung mit 395 nm. Varianten decken das gesamte sichtbare Spektrum ab (CFP, YFP, RFP, mCherry). Fluoreszenz kann mit Fluorometer, Durchflusszytometer oder Mikroskop gemessen werden, was Einzelzell- und Lebendzellanalyse ermöglicht.
- β-Galactosidase (LacZ): spaltet X-Gal zur Bildung eines blauen Niederschlags (kolorimetrisch) oder ONPG zur Bildung eines gelben Produkts (Absorption bei 420 nm). Einfach und kostengünstig, aber weniger empfindlich als Luciferase.
- SEAP (sezernierte alkalische Phosphatase): wird in das Kulturmedium sezerniert, was wiederholte Probenahme aus derselben Kultur ohne Lyse der Zellen ermöglicht. Gemessen mit einem chemilumineszenten Substrat.
- CAT (Chloramphenicolacetyltransferase): der klassische Reporter, nachgewiesen durch ELISA oder radioaktiven Assay. Heutzutage weitgehend durch Luciferase und GFP ersetzt.
Dual-Luciferase-Assays
Dual-Luciferase-Assays verwenden Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase in derselben Probe. Der Testpromotor treibt die Glühwürmchen-Luciferase an, und ein konstitutiver Promotor (z. B. SV40, TK) treibt die Renilla-Luciferase als interne Kontrolle. Nach der Messung der Glühwürmchen-Lumineszenz löscht ein Reagenz diese und aktiviert die Renilla-Lumineszenz. Das Verhältnis Glühwürmchen/Renilla normalisiert für Transfektionseffizienz und Zellzahl.
Anwendungen
Reporter-Assays werden verwendet, um:
- Promotor- und Enhancer-Regionen zu kartieren
- Transkriptionsfaktoraktivität zu untersuchen
- Signalwegsaktivierung zu messen (z. B. NF-κB, CREB, STAT)
- Nach Verbindungen zu screenen, die die Genexpression modulieren
- miRNA-Aktivität zu überwachen (3′-UTR-Reporter)
- Transfektionseffizienz zu quantifizieren
