Übersicht
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist der am häufigsten verwendete Algorithmus zum Vergleich einer Abfragesequenz mit einer Datenbank bekannter Sequenzen. Es identifiziert schnell statistisch signifikante lokale Ausrichtungen, liefert funktionelle Anmerkungen für neue Gene, erkennt Homologien zwischen entfernten Arten und deckt evolutionäre Beziehungen auf. BLAST opfert die garantierte Optimalität der volldynamischen Programmierung für eine Heuristik, die schnell genug ist, um Datenbanken mit Milliarden von Residuen zu durchsuchen. Die statistische Signifikanz jedes Treffers wird als E-Wert angegeben – die erwartete Anzahl zufälliger Übereinstimmungen mit einem bestimmten Wert in einer Datenbank dieser Größe.
Schlüsselkonzepte
BLAST funktioniert, indem es die Abfrage zunächst in kurze Wörter aufteilt (normalerweise 3 für Proteine, 11 für Nukleotide), die Datenbank nach genauen Übereinstimmungen mit diesen Wörtern durchsucht und dann vielversprechende Übereinstimmungen in beide Richtungen erweitert, um längere Alignments zu erstellen. Varianten adressieren spezifische Anwendungsfälle: BLASTP vergleicht Proteinabfragen mit Proteindatenbanken, BLASTN vergleicht Nukleotidabfragen mit Nukleotiddatenbanken, BLASTX übersetzt eine Nukleotidabfrage in alle sechs Leserahmen für den Vergleich auf Proteinebene und PSI-BLAST erstellt iterativ eine positionsspezifische Bewertungsmatrix, um entfernte Homologe zu erkennen. MegabLAST ist für sehr ähnliche Sequenzen optimiert, während diskontinuierliches MegabLAST artenübergreifende Vergleiche durchführt.
Anwendungen
BLAST ist der erste Schritt zur Annotation von Unbekannten aus DNA-Sequenzierungsprojekten. Es weist neuartigen Proteinen eine mutmaßliche Funktion zu, indem es Homologie zu charakterisierten Proteinstrukturen erkennt. In [Bakteriengenetik](/guides/bakterielle-genetics.html) identifiziert BLAST Virulenzfaktoren und Antibiotikaresistenzgene. Rekombinante DNA-Technologie verwendet BLAST, um die Konstruktintegrität zu überprüfen, indem Sequenzierungslesevorgänge mit erwarteten Vektorsequenzen abgeglichen werden.
Praktisches Protokoll
Standardmäßige BLAST-Suchen werden über die NCBI-Webschnittstelle oder die Befehlszeile ausgeführt. Für eine Proteinabfrage für die NR-Datenbank mit Befehlszeilen-BLAST: „blastp -query query.fasta -db nr -out results.txt -evalue 1e-5 -num_threads 8 -outfmt „6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore stitle““. „-outfmt 6“ erzeugt eine tabellarische Ausgabe, die sich ideal für die nachgelagerte Analyse eignet. Der E-Wert (Erwartungswert) stellt die Anzahl der zufällig erwarteten Treffer bei einem bestimmten Wert angesichts der Datenbankgröße dar – Werte < 1 × 10⁻⁵ für Proteine oder < 1 × 10⁻¹⁰ für Nukleotide weisen auf eine signifikante Homologie hin. Der Bit-Score ist ein normalisierter Score, unabhängig von der Datenbankgröße, der einen Vergleich über Suchvorgänge hinweg ermöglicht; Werte über 50 sind in der Regel für Proteine aussagekräftig. Für eine übersetzte Suche (Nukleotidabfrage gegen Proteindatenbank) verwenden Sie BLASTX: „blastx -query ests.fasta -db swissprot -out blowx_results.txt -evalue 1e-5“. Für sehr ähnliche Sequenzen verwenden Sie MegabLAST: „blastn -task megablast -query query.fna -db nt -out megablast_results.txt -evalue 1e-50“. Parameter optimieren: Wortgröße auf 2 (für Proteine) oder 7 (für Nukleotide) reduzieren, um die Empfindlichkeit für entfernte Homologe zu erhöhen; Erhöhen Sie den Schwellenwert für die Verlängerung von Seed-Hits. Führen Sie für die iterative Profilsuche PSI-BLAST aus: „psiblast -query seeds.fasta -db nr -out psi_results.txt -num_iterations 3 -evalue 1e-3“. PSI-BLAST erstellt aus den Treffern der ersten Runde eine positionsspezifische Bewertungsmatrix (PSSM) und verwendet sie für nachfolgende Runden, um entfernte Homologe zu erkennen, die Standard-BLAST übersieht. Für umfangreiche Batch-Suchen verwenden Sie „diamond“, das 100–1000-mal schneller als BLASTP ist: „diamond blowp -d nr.dmnd -q query.fasta -o diamant_results.txt –outfmt 6 –evalue 1e-5 –threads 16“.
