Die Strep-Tag-Reinigung verwendet einen kurzen Peptid-Tag (Strep-tag II), der spezifisch an modifiziertes Streptavidin (Strep-Tactin) bindet, für eine schonende, einstufige Proteinreinigung unter physiologischen Bedingungen ohne Metallionen oder Reduktionsmittel.
Prinzip
Das Strep-tag II ist eine acht Aminosäuren lange Peptidsequenz (WSHPQFEK), die die Interaktion von Biotin mit Streptavidin nachahmt. Es bindet an Strep-Tactin, eine modifizierte Variante des Streptavidins mit einer veränderten Bindungstasche, die das Peptid mit hoher Affinität (K_d ≈ 1 µM) aufnimmt. Die Bindung ist reversibel: Die Elution verwendet 2,5 mM Desthiobiotin, ein Biotin-Analogon, das den Tag kompetitiv verdrängt. Desthiobiotin bindet schwächer als Biotin und wird während des Pufferaustauschs entfernt, was die Harzregeneration ermöglicht. Alternativ kann 10 mM Biotin für eine vollständige Elution verwendet werden, verhindert jedoch die Wiederverwendung des Harzes. Das gesamte Verfahren ist mit physiologischen Puffern kompatibel und bewahrt die native Proteinstruktur und -aktivität.
Twin-Strep-Tag
Der Twin-Strep-Tag (zwei Strep-tag II-Sequenzen hintereinander, getrennt durch einen kurzen Linker) verbessert die Bindungsaffinität dramatisch (K_d ≈ 10⁻¹¹ M) und ermöglicht die Erfassung von Proteinen, die in sehr geringen Mengen exprimiert werden, sowie die Reinigung aus verdünnten Proben. Er ermöglicht auch die quantitative Erfassung von Proteinkomplexen. Der Twin-Strep-Tag wird für anspruchsvolle Zielproteine und für die Affinitätserfassung von Protein-Interaktionspartnern aus endogenen Expressionsniveaus empfohlen.
Harze und Formate
Strep-Tactin-Agarose (IBA Lifesciences, jetzt Teil von Cube Biotech) bietet eine Bindungskapazität von etwa 50 nmol Strep-tag II-Peptid pro mL (≈1,3 mg eines 26-kDa-Proteins). Strep-Tactin Superflow-Hochleistungsharz ist mit FPLC-Systemen bei Flussraten bis zu 5 mL/min kompatibel. Strep-Tactin-Magnetkügelchen sind für die Reinigung im kleinen Maßstab und für Pull-Down-Experimente erhältlich. Strep-TactinXT ist eine verbesserte Version mit höherer Affinität für das konventionelle Strep-tag II, wodurch der größere Twin-Strep-Tag in den meisten Anwendungen überflüssig wird.
Puffer
Beladungs-/Waschpuffer: 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Elutionspuffer: Beladungspuffer plus 2,5 mM Desthiobiotin. Regenerationspuffer: 1 mM HABA (Hydroxyazophenyl-Benzoesäure) oder 10 mM Biotin in Beladungspuffer, um restliches gebundenes Protein oder Desthiobiotin zu entfernen. Der Puffer ist kompatibel mit Reduktionsmitteln (< 2 mM DTT oder TCEP) und milden Detergenzien (0,1 % Triton X-100, 0,05 % NP-40). Starke Reduktionsmittel (> 10 mM DTT) und biotinhaltige Lösungen (> 2 µM) sollten im Beladungsschritt vermieden werden, da sie die Bindung beeinträchtigen.
Protokoll
Strep-Tactin-Harz mit Beladungspuffer äquilibrieren. Geklärtes Lysat laden (Batch-Inkubation 30 min, 4 °C, oder Säule bei 0,5–1 mL/min). Mit 10–20 Säulenvolumina Beladungspuffer waschen. Mit 6–10 Säulenvolumina Elutionspuffer (Desthiobiotin) eluieren. Bei Verwendung von Biotin mit 5 Säulenvolumina eluieren und beachten, dass das Harz nicht wiederverwendet werden kann. Mit HABA- oder Biotinpuffer regenerieren, dann für die Wiederverwendung bis zu fünfmal äquilibrieren. Fraktionen sammeln und durch SDS-PAGE analysieren.
Vorteile
Der Strep-Tag ist klein (8 Aminosäuren, 1 kDa) und beeinträchtigt selten die Proteinfunktion, was die Tag-Entfernung für die meisten Anwendungen überflüssig macht. Die Elution mit Desthiobiotin unter physiologischen Bedingungen erhält die enzymatische Aktivität, die Komplexintegrität und die Antikörperbindung. Das System ist mit dem His-Tag für Dual-Tag-Reinigungen kompatibel. Das Fehlen von Metallionen eliminiert das Risiko der metallkatalysierten Oxidation. Zu den Anwendungen gehören die rekombinante Proteinreinigung, die Proteinkomplexisolierung und der Pull-Down von Interaktionspartnern.
