Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) misst die Bindung und Dissoziation von Molekülen in Echtzeit ohne fluoreszierende oder radioaktive Markierungen. Sie ist der Goldstandard zur Bestimmung der Bindungsaffinität (KD), Assoziationsraten (ka) und Dissoziationsraten (kd).

Prinzip

SPR detektiert Änderungen des Brechungsindex an einer Goldsensoroberfläche. Ein Interaktionspartner (der Ligand) wird auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Eine Lösung, die den anderen Interaktionspartner (den Analyten) enthält, fließt über die Oberfläche. Wenn Analytmoleküle an den Liganden binden, nimmt die Masse an der Oberfläche zu, was den Brechungsindex verändert. Diese Änderung wird kontinuierlich gemessen und als Sensorgramm (Antwort in Resonanzeinheiten gegen die Zeit) dargestellt.

Sensorgramm

Ein typisches SPR-Experiment besteht aus:

1. Basislinie: Puffer fließt über die Oberfläche.
2. Assoziation: Analyt wird injiziert; die Antwort steigt mit der Bindung.
3. Gleichgewicht: die Bindungsrate gleicht der Dissoziationsrate; die Antwort erreicht ein Plateau.
4. Dissoziation: Puffer ersetzt den Analyten; die Antwort nimmt ab, während der Komplex dissoziiert.

Mehrere Analytenkonzentrationen werden über dieselbe Ligandenoberfläche injiziert, um eine Reihe von Sensorgrammen zu erzeugen. Die globale Anpassung der Daten an ein 1:1-Bindungsmodell ergibt ka, kd und den berechneten KD (= kd/ka).

Instrumentierung

Das Biacore (Cytiva) ist die am weitesten verbreitete SPR-Plattform. Der Sensorchip hat eine Goldoberfläche, die mit einer carboxymethylierten Dextranmatrix beschichtet ist, die eine hydrophile Umgebung für die Immobilisierung bietet. Andere Plattformen umfassen Sierra Sensors, Reichert und Nicoya.

Immobilisierungsmethoden

• Amin-Kopplung: die gebräuchlichste Methode. Die Carboxylgruppen auf der Dextranoberfläche werden mit EDC/NHS aktiviert, um reaktive Ester zu bilden, die mit primären Aminen am Liganden reagieren. Einfach, aber zufällige Orientierung.
• Capture-Kopplung: ein Fangmolekül (Anti-His-Antikörper, Streptavidin, Protein A) wird amin-gekoppelt, und der Ligand wird aus einer rohen oder gereinigten Präparation gefangen. Dies gewährleistet eine gleichmäßige Orientierung und ermöglicht die Regeneration der Oberfläche, ohne den Liganden zu beschädigen.
• Biotin-Streptavidin: biotinylierte Liganden werden auf einer Streptavidin-beschichteten Oberfläche gefangen. Nahezu kovalente Stabilität mit orientierter Immobilisierung.

Anwendungen

• Affinitätsranking: Screening von Antikörperklonen auf die höchste Affinität.
• Epitop-Binning: Bestimmung, ob zwei Antikörper überlappende Epitope binden.
• Konzentrationsanalyse: Messung der aktiven Konzentration mittels eines kalibrationsfreien Ansatzes.
• Kleinmolekülanalyse: moderne SPR-Instrumente detektieren Moleküle von nur 100 Da.
• Kinetische Charakterisierung: vollständige ka-, kd- und KD-Bestimmung für Arzneimittelkandidaten.

Einschränkungen

SPR erfordert relativ reinen Liganden und Kenntnis der Bindungsstöchiometrie. Massentransportlimitierung (der Analyt bindet schneller, als er zur Oberfläche diffundieren kann) kann die Kinetik verzerren und wird durch hohe Flussraten und niedrige Ligandendichten adressiert. Unspezifische Bindung an die Oberfläche oder Matrix muss durch Optimierung des Laufpuffers (Zugabe von Tensid, BSA oder Glycerol) minimiert werden.