Bevor CRISPR/Cas9 zur dominierenden Plattform für die Genomeditierung wurde, waren Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen (ZFNs) die wichtigsten Werkzeuge für gezielte Genomveränderungen. Beide verwenden eine modulare DNA-bindende Domäne, die mit der Endonukleasedomäne von FokI fusioniert ist.

Zinkfingernukleasen

Ein ZFN besteht aus 3–6 Zinkfingermodulen, von denen jedes 3–4 bp DNA erkennt. Zwei ZFN-Monomere binden an benachbarte Stellen mit einem 5–7 bp Spacer dazwischen. FokI muss dimerisieren, um DNA zu schneiden, sodass nur der gepaarte ZFN-FokI-Komplex einen Doppelstrangbruch erzeugt.

Zinkfingermodule sind nicht wirklich modular: Die Spezifität jedes Fingers wird durch seine Nachbarn beeinflusst, was das ZFN-Design erschwert. Die meisten ZFNs müssen aus großen kombinatorischen Bibliotheken ausgewählt oder mit proprietären Plattformen (Sangamo Biosciences) entwickelt werden. Diese Komplexität begrenzte die ZFN-Adoption trotz ihrer Erfolge in frühen therapeutischen Studien (SB-728-T für HIV, Phase 1).

TALENs

TALENs verwenden die DNA-bindende Domäne von Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektoren aus Xanthomonas-Bakterien. Jeder TAL-Repeat erkennt ein einzelnes Nukleotid durch zwei hypervariable Aminosäurereste (das Repeat-Variable-Diresidue, RVD). Der Code ist einfach und vorhersagbar:

• HD → C
• NG → T
• NI → A
• NN → G oder A
• NH → G (höhere Spezifität)

Ein typisches TALEN-Array hat 12–20 Repeats, die auf eine 12–20 bp Sequenz abzielen. Wie ZFNs werden TALENs als Paar verwendet, das einen 12–20 bp Spacer flankiert, wobei die FokI-Domänen über den Spacer hinweg dimerisieren.

Der TALEN-Zusammenbau ist modular, jeder Repeat ist ein standardisierter Teil, und Methoden wie die Golden-Gate-Klonierung (MoClo, Golden TALEN, FLASH) ermöglichen die Assemblierung von TALEN-Arrays aus vorgefertigten Repeat-Modulen.

Vergleich mit CRISPR/Cas9

TALENs bieten die niedrigste Off-Target-Rate aller drei Plattformen, da die Zielstelle länger ist und jeder TAL-Repeat ein einzelnes Nukleotid bindet. Die große Größe jedes TALEN-Monomers (~3 kb) erschwert jedoch den Transport in AAV-Vektoren. ZFNs sind klein genug für die AAV-Verpackung, aber schwer im Eigenbau zu entwickeln.

Anwendungen

ZFNs und TALENs werden immer noch in Anwendungen eingesetzt, bei denen Off-Target-Schnitte absolut minimiert werden müssen (z. B. therapeutische Editierung in Stammzellen) oder wenn die CRISPR-PAM-Anforderungen restriktiv sind. TALENs haben keine PAM-Anforderung und können jede Sequenz angreifen, einschließlich Sequenzen ohne NGG-PAM.