Über die grundlegende CRISPR/Cas9-Genbearbeitung hinaus umfasst das Genome-Engineering gepooltes funktionelles Screening und alternative Nukleasen für präzise Sequenzmodifikationen.

CRISPR-Screening

CRISPR-Screening ist eine hochdurchsatz-funktionelle Genomikmethode, die gepoolte lentivirale Bibliotheken von single-guide RNAs (sgRNAs) verwendet, um jedes Gen im Genom auszuschalten und diejenigen zu identifizieren, die an einem Phänotyp von Interesse beteiligt sind.

Ein typischer Screen:

1. Eine lentivirale sgRNA-Bibliothek (z. B. Brunello-Bibliothek: 4 sgRNAs pro Gen, 77.000 sgRNAs insgesamt) wird in Cas9-exprimierende Zellen bei niedriger Multiplizität der Infektion (~0,3) transduziert, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen eine sgRNA erhalten.
2. Die Zellen werden einem Selektionsdruck ausgesetzt: Medikamentenbehandlung, Toxinexposition oder einem sortierungsbasierten Phänotyp (z. B. einem Reporter für einen Signalweg).
3. Genomische DNA wird extrahiert, und sgRNA-Sequenzen werden mittels PCR amplifiziert und durch Next-Generation-Sequencing quantifiziert.
4. sgRNAs, die in der behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrolle abgereichert oder angereichert sind, identifizieren Gene, die für das Überleben oder die Resistenz essenziell sind.

CRISPR-Screens sind empfindlicher und spezifischer als shRNA-Screens, da Cas9 vollständige Knockouts erzeugt und weniger Off-Target-Effekte aufweist.

TALENs

Transkriptionaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) sind künstliche Restriktionsenzyme, die durch Fusion einer TAL-Effektor-DNA-Bindedomäne mit der Nukleasedomäne von FokI hergestellt werden. Jede TAL-Effektor-Wiederholung erkennt ein einzelnes DNA-Basenpaar, was die modulare Assemblierung von Bindedomänen ermöglicht, die jede Sequenz adressieren können.

Die FokI-Domäne muss dimerisieren, daher werden TALENs in Paaren verwendet, die die Zielstelle flankieren. Die Dimerisierung erzeugt einen Doppelstrangbruch (DSB) am Ziel, der durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) — mit kleinen Insertionen oder Deletionen — oder durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) repariert wird, wenn eine Reparaturmatrize bereitgestellt wird.

TALENs sind spezifischer als frühe CRISPR-Systeme, aber aufwändiger zu konstruieren, da jedes neue Ziel die Assemblierung eines neuen Wiederholungsarrays erfordert.

Zinkfingernukleasen (ZFNs)

ZFNs fusionieren Zinkfingerdomänen (jede erkennt ~3 bp) mit der FokI-Nukleasedomäne. Wie TALENs erfordern sie gepaarte Bindungsstellen und FokI-Dimerisierung für die Aktivität. ZFNs waren die ersten weit verbreiteten gezielten Nukleasen, wurden aber weitgehend durch CRISPR und TALENs ersetzt, aufgrund der Schwierigkeit, Zinkfinger-Arrays mit hoher Spezifität zu konstruieren.

Auswahl eines Ansatzes

• CRISPR ist am einfachsten und skalierbarsten — geeignet für genomweite Screens und Routine-Editing.
• TALENs bieten geringeres Off-Target-Editing und werden bevorzugt, wenn eine präzise Einzelbasenerkennung erforderlich ist oder wenn in Organismen editiert wird, in denen CRISPR-PAM-Einschränkungen limitierend sind.
• ZFNs bleiben in spezifischen Kontexten nützlich, wie Gentherapie (wo kleinere Größe die virale Verpackung erleichtert) und in Organismen, in denen die anderen Werkzeuge weniger entwickelt sind.