Übersicht
Bei der Transkriptomassemblierung handelt es sich um die rechnerische Rekonstruktion exprimierter Transkriptsequenzen aus RNA-seq-Reads, die entweder mit oder ohne Referenzgenom durchgeführt wird. Für Organismen, denen ein sequenziertes Genom fehlt, ist die De-novo-Transkriptomassemblierung die einzige Option, die einen ersten Einblick in das Kodierungspotenzial eines Organismus bietet. Selbst wenn ein Referenzgenom verfügbar ist, kann die Transkriptomassemblierung neue Isoformen, Fusionstranskripte und Sequenzen aus schlecht zusammengesetzten Genomregionen erfassen. Das zusammengesetzte Transkriptom dient als Grundlage für nachgelagerte Analysen, einschließlich Expressionsquantifizierung, funktioneller Annotation und Vergleichsstudien.
Methoden
Die De-novo-Transkriptomassemblierung verwendet Assemblierungsalgorithmen, die für ungleichmäßige Abdeckung und alternatives Spleißen ausgelegt sind. Zu den beliebten Tools gehören Trinity, das einen De-Bruijn-Graph-Ansatz mit mehreren k-mer-Größen verwendet; rnaSPAdes, adaptiert aus der Genomassemblierung; und SOAPdenovo-Trans. Diese Tools fügen Lesevorgänge zu Contigs zusammen, die Transkriptfragmente darstellen, gruppieren dann verwandte Contigs in Isoformengruppen und lösen Transkripte voller Länge auf. Referenzgesteuerte Assembler (StringTie, Cufflinks) nutzen spleißbewusste Alignments zum Genom und fügen überlappende Lesevorgänge zu Transkriptmodellen zusammen. Zu den wichtigsten Qualitätsmetriken gehören die Vollständigkeit der Assemblierung (BUSCO-Scores gegenüber konservierten Orthologen), die N50-Länge und die Anzahl der wiederhergestellten Transkripte in voller Länge. Redundanzreduzierung mithilfe von CD-HIT oder Corset gruppiert sehr ähnliche Transkripte.
Anwendungen
Die Transkriptomassemblierung ermöglicht die Entdeckung von Genen in Nicht-Modellorganismen, von landwirtschaftlichen Nutzpflanzen bis hin zu wenig erforschten Meeresarten. Es identifiziert unterschiedlich exprimierte Gene, gewebespezifische Isoformen und Fusionstranskripte bei Krebs. Die Technik ist unerlässlich, wenn Daten zur RNA-Sequenzierung von Organismen ohne Referenz stammen, und sie lässt sich tief in die Arbeitsabläufe der Nächsten-Generation-Sequenzierung integrieren. Zusammengesetzte Transkriptome tragen auch zu Evolutionsstudien bei, indem sie artübergreifende Vergleiche von [RNA-Struktur und -Typen] ermöglichen (/guides/rna-structure-and-types.html). Mit der Verbesserung der Long-Read-Sequenzierung (Iso-Seq, Oxford Nanopore) führen hybride Assemblierungsstrategien, die kurze und lange Reads kombinieren, zu vollständigeren und genaueren Transkriptomen als je zuvor.
Praktisches Protokoll
Stellen Sie für die De-novo-Transkriptomassemblierung mit Trinity zunächst sicher, dass die RNA-seq-Lesevorgänge einem Qualitätstrimmen mit Trimmomatic unterzogen wurden. Führen Sie Trinity mit dem Befehl aus: „Trinity –seqType fq –max_memory 50G –CPU 8 –left reads_R1.fastq –right reads_R2.fastq –output trinity_out_dir“. Trinity arbeitet in drei Modulen: Inchworm fügt k-mer-Graphen zu Contigs zusammen, Chrysalis clustert Contigs zu de Bruijn-Graphen, die vollständige Transkriptvarianten darstellen, und Butterfly verfolgt Pfade durch diese Graphen, um Isoformensequenzen zu rekonstruieren. Die Ausgabe ist „Trinity.fasta“ und enthält zusammengestellte Transkripte. Bewerten Sie die Assemblierungsqualität mit „BUSCO“ anhand des entsprechenden Abstammungsdatensatzes: „busco -i Trinity.fasta -l eukaryota_odb10 -o busco_out -m transcriptome“. Eine vollständige BUSCO-Bewertung über 80 % weist auf eine qualitativ hochwertige Montage hin. Zu den zusätzlichen Metriken gehören Contig N50 (berechnet mit „TrinityStats.pl Trinity.fasta“) und die Anzahl der zusammengesetzten Transkripte, die über BLASTX mit UniProt mit bekannten Proteinen übereinstimmen. Reduzieren Sie die Redundanz mit „CD-HIT-EST -c 0.95 -i Trinity.fasta -o Trinity_nr.fasta“, um Isoformen mit 95 % Identität zu gruppieren. Für die referenzgesteuerte Assemblierung mit StringTie richten Sie die Lesevorgänge zunächst mit STAR aus: „stringtie -p 8 -G annotation.gtf -oassembly.gtfaligned.bam“. StringTie stellt Transkripte mithilfe eines Netzwerkflussalgorithmus zusammen und kann zur Entdeckung neuer Transkripte ohne Referenz-GTF ausgeführt werden. Führen Sie Baugruppen über mehrere Proben hinweg mit „stringtie –merge“ zusammen, um ein einheitliches Transkriptom zu erstellen. Quantifizieren Sie den Ausdruck mit „stringtie -e -B“ und verwenden Sie „prepDE.py“, um eine Zählmatrix für die Differentialausdrucksanalyse zu generieren.
